Индукция ишемии-реперфузионного повреждения сетчатки на модели глаза мыши

Резюме

Этот протокол моделирует ишемию-реперфузионное повреждение сетчатки в глазу мыши путем индуцирования ишемии сетчатки через канюляцию передней камеры и повышения внутриглазного давления с последующей нормализацией внутриглазного давления для инициирования реперфузии.

Аннотация

Известно, что ишемические реперфузионные повреждения вызывают ряд патологий сетчатки, включая диабетическую ретинопатию, глаукому, окклюзии сосудов сетчатки и другие вазоокклюзионные состояния. В данной рукописи представлен метод индуцирования ишемии-реперфузионного повреждения на мышиной модели. Метод использовал канюляцию передней камеры, прикрепленную к резервуару с солевым раствором, создавая гидростатическое давление для повышения внутриглазного давления до 90-100 мм рт.ст. Этот метод эффективно вызывал сужение капилляров сетчатки, вызывая ишемию ишемии сетчатки. В конце ишемического периода (60 мин) внутриглазное давление нормализовалось (≤20 мм рт.ст.) перед удалением канюли из передней камеры для инициирования реперфузии. Через несколько дней после процедуры ишемии/реперфузии глаза были собраны и разрезаны для гистологического окрашивания. Гистопатология срезов сетчатки оценивалась путем оценки восьми параметров повреждения сетчатки: складок, кровоизлияния, деформации, потери клеток в ганглиозной клетке, внутреннем, наружном ядерном и фоторецепторном слоях, а также повреждения клеток пигментного эпителия сетчатки. Этот метод позволил получить воспроизводимую модель для изучения механизмов и патологии ишемии/реперфузионного повреждения сетчатки. Кроме того, эта модель может способствовать обнаружению потенциальных терапевтических мишеней для лечения ишемии/реперфузионного повреждения сетчатки, продвигая изучение патологий сетчатки и улучшая результаты лечения пациентов.

Введение

Ишемия/реперфузионные повреждения проявляются различными патологиями сетчатки, включая диабетическую ретинопатию, глаукому, окклюзии сосудов сетчатки и связанные с ними вазоокклюзионные состояния. Учитывая высокую потребность сетчатки в кислороде, она особенно восприимчива к ишемии/реперфузионному повреждению, явлению, участвующему в патогенезе таких заболеваний, как диабетическая ретинопатия. Эта форма повреждения приводит к гибели ганглиозных клеток сетчатки (РГК), морфологической дегенерации сетчатки, нарушению функции сетчатки и возможному нарушению зрения¹. Моделирование ишемии/реперфузии целесообразно для изучения механизмов и реакций на лечение при различных патологиях сетчатки, связанных с ишемией/реперфузионными повреждениями.

Мы сосредоточились на уточнении модели ишемии/реперфузионного повреждения глаза мыши. Модель канюляции передней камеры при ишемической травме сетчатки, вызванной давлением, была впервые опубликована Büchi et al. в 1991 году^. Они успешно повысили внутриглазное давление до 110 мм рт.ст. в течение контролируемого времени. Они обнаружили, что полученное повреждение сетчатки согласуется с результатами, аналогичными окклюзии сетчатки и сосудистой оболочки глаза. Благодаря относительно простой методологии и экономичному исполнению, он стал функциональной моделью для изучения ишемического повреждения сетчатки. Мы добавили дополнительный шаг опускания источника инфузии до уровня мыши перед извлечением иглы. Это предотвратило образование возможного повышенного перепада давления в глазу при удалении иглы, что привело к внутриглазному повреждению, не связанному с ишемией/реперфузией.

Цель работы состояла в том, чтобы создать контролируемую и воспроизводимую модель для исследования механизмов и патологии ишемического/реперфузионного повреждения сетчатки на мышиной модели при минимизации процедурного повреждения глаза. Эта модель предлагает способ определения потенциальных методов лечения и улучшения нашего понимания патологий сетчатки, связанных с окклюзией сосудов.

протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с протоколом использования животных, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и использованию Бостонского университета в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и в соответствии с заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.

1. Подопытные животные

1. Домашние мыши C57BL/6J в стандартных условиях.

2. Приготовление необходимого раствора и инфузионной линии

1. В шприц объемом 50 мл залейте стерилизованным 0,9% физиологическим раствором NaCl из расчета по одному раствору на мышь. Расположите шприц на высоте 120 см над уровнем поверхности скамейки.
2. Подсоедините наполненный шприц к инфузионной линии и запорному крану с иглой 30 G, прикрепленной к концу линии. Промойте все пузырьки воздуха из магистрали.

3. Подготовка рабочего пространства

1. Установите хирургический/препарирующий микроскоп под бутылку с физиологическим раствором.
2. Создайте кровать для стабилизации мыши во время процедуры, вырезав углубление примерно 6 см х 3 см в губке и надежно поместив его в лунку из пенопласта или другую плоскую емкость.

4. Обезболивание мыши

1. Обезболивайте мышь стандартной смесью кетамина и ксилазина на уровне, чтобы добиться глубокой анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе смесь кетамина 100 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг вводилась внутрибрюшинно для достижения адекватной глубины анестезии.
2. Достигайте адекватной анестезии, когда нет отведения лапы в ответ на защемление пальца ноги и нет мигательного рефлекса при нежном прикосновении к роговице. Введите дополнительную анестезию, если мышь проявляет какие-либо признаки боли, такие как гипервентиляция или движение конечностей, во время анестезии.

5. Расширение радужной оболочки глаза

1. Расширяйте радужную оболочку глаза для перфузии 1 каплей 1% тропикамид. Подождите 5 минут для расширения. Нанесите на глаз офтальмологическую мазь, такую как бацитрацин, которая не будет перфузироваться.

6. Канюляция передней камеры

1. Надежно поместите мышь под наркозом в губчатую подстилку под микроскопом. Нанесите солевой раствор на глаза, чтобы смыть мусор или шерсть с поверхности глаз.
2. Используйте пару щипцов без зубьев и аккуратно подойдите к одному из глаз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В эксперименте будут использоваться либо левый, либо правый глаз мыши, но никогда не будут использоваться оба глаза на одной и той же мыши.
3. Когда инфузионная линия закрыта, канюлировать переднюю камеру иглой примерно в 2 мм от лимба. Убедитесь, что игла прокалывает роговицу перпендикулярно периферической, изогнутой поверхности роговицы, а затем слегка приплюснутой параллельно плоскости радужной оболочки. Роговицей можно манипулировать для продвижения иглы и поддержания контроля над глазами. Избегайте ударов по радужной оболочке или хрусталику и увеличения раны роговицы, что может привести к утечке. Подробности более подробно описаны в работе Buchi et ^al.2.

7. Ишемическая фаза

1. Поверните запорный кран, чтобы запустить инфузионную линию. Убедитесь, что нет утечки через рану роговицы. Следите за тем, чтобы происходило постепенное растяжение роговицы по мере повышения внутриглазного давления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если значительная утечка не герметизируется при растяжении роговицы, адекватное давление не будет поддерживаться, и процедуру придется проводить на другой мыши.
2. Проверьте тонометром, что внутриглазное давление повысилось до 90-100 мм рт.ст. Закрепите инфузионную линию лентой, тщательно следя за тем, чтобы игла не изменила положение и не начала протекать.
3. Нанесите на перфузию глаза офтальмологическую мазь, такую как бацитрацин, чтобы предотвратить сухость. Поместите мышь подальше от микроскопа и под нагревательную лампу, чтобы поддерживать нормальную температуру тела, и наблюдайте за ней в течение следующих 60 минут.
4. Повторно измерьте внутриглазное давление за 30 минут до окончания процедуры, чтобы убедиться, что внутриглазное давление находится в пределах 90-100 мм рт.ст.

8. Фаза реперфузии

1. Через 60 минут верните мышь в микроскоп. Опустите флакон с солевым раствором до уровня мыши, нормализовав внутриглазное давление.
2. Измерьте внутриглазное давление с помощью тонометрии, чтобы убедиться, что оно близко к норме, 20 мм рт.ст. Как только внутриглазное давление нормализуется, осторожно извлеките иглу, не допуская повреждения хрусталика или радужной оболочки.

9. Послеоперационный уход

1. Покройте глаза мыши любой офтальмологической антибактериальной мазью, например, ветеринарной офтальмологической мазью с бацитрацином.
2. Следите за мышами в течение 1-2 ч на нагретой поверхности до тех пор, пока они полностью не восстановятся после анестезии. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Верните мышей в клетки и жилье после полного выздоровления.

10. Энуклеация глаза³

1. Сначала обезболите мышь смесью кетамина 100 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг, вводимой внутрибрюшинно, а затем усыпите через вывих шейки матки.
2. Поместите усыпленную мышь на ровную, сухую и гладкую поверхность. Промойте глаз несколькими каплями солевого раствора.
3. Осторожно надавливайте щипцами на боковой кантус до тех пор, пока глазное яблоко не будет смещено из глазницы и зрительный нерв не станет доступным. С помощью ножниц Westcott разрежьте по краям орбиты, чтобы разорвать экстраокулярные мышцы.
4. Расположите ножницы Westcott на самой задней стороне глазницы и перережьте зрительный нерв.

11. Фиксация образца⁴

1. Поместите энуклеированный глаз в 4% параформальдегид в дозе 0,1 М PBS в герметичном флаконе. Через 3 дня удалите глаз, поместите его во флакон с 70% раствором этанола и уберите на ночь.
2. Удалите глаза и поместите их во флакон с 95% раствором этанола. Затем поместите флакон в герметичный вакуум на 15 минут, выньте его из вакуума и оставьте на комнатном воздухе на 45 минут.
3. Повторите процесс вакуума, последовательно помещая глаз в следующие растворы: 100% этанол, 100% этанол, 100% раствор ксилола и 100% раствор ксилола.
4. Извлеките глаз и поместите его в чистый пустой флакон. Наполните флакон жидким парафином с температурой 60 °C. Поместите флакон в герметичную вакуумную духовку при температуре 60 °C на 30 минут, а затем на 30 минут в духовку при температуре 60 °C без вакуума.
5. Извлеките глаз, поместите его в чистый пустой флакон и наполните его жидким парафином с температурой 60 °C. Храните флакон при температуре 60 °C в течение ночи.

12. Встраивание образца

1. Перенесите глаз в металлическую закладную форму и заполните форму жидким парафином на горячей плите с температурой 60 °C, ориентируя глаз в нужном направлении, чтобы сделать срезы через оптический диск. Дайте форме остыть при комнатной температуре (RT), затем храните при температуре 4 °C.

13. Секционирование образца⁵

1. Перенесите внедренные образцы в микротом. Медленно обрезайте блок до тех пор, пока не будет достигнут глаз и секции не включат в себя диск зрительного нерва.
2. Нарежьте срезы на ленты толщиной 5 мкм и поставьте их на водяную баню. Аккуратно поднимите парафиновую ленту с помощью щипцов, наложите ленты из трех секций на предметную горку и дайте ей высохнуть на ночь.
3. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не получится не менее 8 предметных стекол для каждого глаза с участками, центрированными на диске зрительного нерва.

14. Окрашивание участков⁵

1. Нагрейте горки в духовке при температуре 60 °C в течение 1 часа, чтобы парафин расплавился. Погрузите предметные стекла в ксилол RT три раза, на 5 минут каждый.
2. Погрузите предметные стекла в 100% этанол три раза, на 3 минуты каждый. Промойте секции в водопроводной воде в течение 1 минуты.
3. Инкубировать срезы в окрашивании гематоксилином в течение 45 с. Промойте секции в водопроводной воде в течение 2 минут.
4. Инкубируйте срезы в реагенте Bluing в течение 1 мин. Промойте секции в водопроводной воде в течение 1 минуты.
5. Инкубируйте секции в эозине в течение 15 с.
6. Промойте секции в 95% и 100% этаноле дважды по 1 минуте каждая. Промойте секции в 100% ксилоле четыре раза, по 1 минуте каждая. Затем закрепите слайды с помощью монтажного носителя.

15. Гистологический анализ⁶

1. Проанализируйте каждый срез сетчатки под микроскопом и запишите количество складок сетчатки, процент потери клеток в различных слоях сетчатки (слой ганглиозных клеток, внутренний ядерный слой, внешний ядерный слой), наличие стекловидного или субретинального кровоизлияния, а также степень повреждения пигментного эпителия сетчатки. Подробная информация о критериях оценки приведена в таблице 1 .

Результаты

Для оценки патологии сетчатки после ишемии/реперфузии были собраны глаза у одной группы мышей через 2 дня после процедуры и у другой группы мышей через 7 дней после процедуры. Энуклеированные глаза фиксировали в 4% параформальдегиде, погружали в парафин и нарезали на у?...

Обсуждение

Модель ишемии/реперфузии обеспечивает воспроизводимый метод изучения механизмов и патологии ишемии/реперфузионного повреждения сетчатки. Эта модель полезна для изучения патологии ишемии/реперфузионного повреждения сетчатки, а также для определения терапевтическ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401