Induction of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in a Mouse Eye Model

요약

이 프로토콜은 전방삽관 삽입 및 안압 상승을 통해 망막 허혈을 유도한 다음 안압 정상화를 통해 재관류를 시작하여 마우스 눈의 망막 허혈-재관류 손상을 모델링합니다.

초록

허혈-재관류 손상은 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막 혈관 폐색 및 기타 혈관 폐색 상태를 포함한 다양한 망막 병리를 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 이 원고는 마우스 모델에서 허혈-재관류 손상을 유도하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 식염수 저장소에 부착된 전방 챔버 캐뉼레이션을 사용하여 정수압을 생성하여 안압을 90-100mmHg로 올렸습니다. 이 방법은 망막 모세혈관의 수축을 효과적으로 유발하여 망막 허혈을 유발했습니다. 허혈 기간(60분)이 끝나면 재관류를 시작하기 위해 전방에서 캐뉼라를 제거하기 전에 안압을 정상화(≤20mmHg)했습니다. 허혈/재관류 시술 후 며칠 후, 눈을 채취하여 조직학적 염색을 위해 절편화했습니다. 망막 부분의 조직병리학은 망막 손상의 8가지 매개변수, 즉 주름, 출혈, 변형, 신경절 세포, 내부 핵, 외부 핵 및 광수용체 층의 세포 손실, 망막 색소 상피 세포의 손상을 평가하여 점수를 매겼습니다. 이 방법은 망막 허혈/재관류 손상의 메커니즘과 병리학을 연구하기 위한 재현 가능한 모델을 제공했습니다. 또한 이 모델은 망막 허혈/재관류 손상을 치료하기 위한 잠재적인 치료 표적의 발견을 촉진하여 망막 병리학 연구를 진전시키고 환자 결과를 개선할 수 있습니다.

서문

허혈/재관류 손상은 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막 혈관 폐색 및 관련 혈관 폐색 상태를 포함하는 다양한 망막 병리학에서 나타납니다. 망막의 높은 산소 요구량을 감안할 때, 당뇨병성 망막병증과 같은 질병의 발병기전과 관련된 현상인 허혈/재관류 손상에 특히 취약합니다. 이러한 형태의 손상은 망막 신경절 세포(RGC)의 사멸, 망막의 형태학적 변성, 망막 기능 손상 및 궁극적인 시력 장애를 초래합니다¹. 허혈/재관류 모델링은 허혈/재관류 손상과 관련된 다양한 망막 병리학의 메커니즘 및 치료 반응에 대한 연구에 적합합니다.

우리는 쥐 눈의 허혈/재관류 손상에 대한 모델을 개선하는 데 중점을 두었습니다. 압력으로 인한 망막 허혈 손상에 대한 전방흡관 캐뉼레이션 모델은 1991년 Büchi 등에 의해 처음 발표되었다². 그들은 통제된 시간 동안 안압을 110mmHg로 성공적으로 증가시켰습니다. 그들은 그로 인한 망막 손상이 망막 및 맥락막 혈관 폐색과 유사한 소견과 일치한다는 것을 발견했습니다. 비교적 간단한 방법론과 비용 효율적인 실행으로 인해 망막 허혈 손상 연구를 위한 기능적 모델이 되었습니다. 바늘을 빼내기 전에 주입 소스를 마우스 높이로 낮추는 추가 단계를 추가했습니다. 이것은 바늘을 제거했을 때 눈 내에서 가능한 높은 압력 차이를 형성하여 허혈/재관류와 관련이 없는 안구 내 손상을 일으키는 것을 방지했습니다.

목표는 눈의 절차적 손상을 최소화하면서 마우스 모델에서 망막 허혈/재관류 손상의 메커니즘과 병리학을 연구하기 위한 통제되고 복제 가능한 모델을 만드는 것이었습니다. 이 모델은 잠재적인 치료법을 식별하고 혈관 폐색과 관련된 망막 병리학에 대한 이해를 향상시키는 방법을 제공합니다.

프로토콜

모든 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 Boston University Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었으며 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명을 준수합니다.

1. 실험동물

1. 표준 조건에서 C57BL/6J 마우스를 수용합니다.

2. 필요한 용액 및 주입 라인 준비

1. 50mL 주사기에 멸균된 0.9% NaCl 식염수를 마우스 1개당 1개씩 채웁니다. 주사기를 벤치 표면 높이에서 120cm 높이에 놓습니다.
2. 채워진 주사기를 주입 라인에 연결하고 라인 끝에 30G 바늘이 부착된 마개에 연결합니다. 라인에서 모든 기포를 씻어냅니다.

3. 작업 공간 준비

1. 식염수 병 아래에 수술/해부 현미경을 설치합니다.
2. 스폰지로 약 6cm x 3cm의 움푹 들어간 곳을 잘라내고 스티로폼 우물이나 다른 평평한 용기에 단단히 넣어 시술 중에 마우스를 안정시킬 수 있는 침대를 만듭니다.

4. 마우스 마취

1. 깊은 마취를 달성하기 위해 케타민과 자일라진의 표준 혼합물로 마우스를 마취합니다.
   참고: 이 프로토콜에서는 적절한 마취 깊이를 달성하기 위해 케타민 100mg/kg과 자일라진 10mg/kg의 혼합물을 복강내 주사했습니다.
2. 발가락 꼬집음에 대한 반응으로 발이 빠지지 않고 각막을 부드럽게 만졌을 때 깜박임 반사가 없을 때 적절한 마취를 달성하십시오. 마우스가 마취 상태에서 과호흡이나 팔다리 움직임과 같은 통증 징후를 보이면 추가 마취를 시행합니다.

5. 홍채 확장

1. 1% 트로피카마이드 1방울로 관류할 눈의 홍채를 확장시킵니다. 확장에 5분 정도 기다립니다. 바시트라신(bacitracin)과 같은 안과용 연고를 관류되지 않는 눈에 바르십시오.

6. 전방 챔버 캐뉼레이션

1. 마취된 마우스를 현미경 아래의 스폰지 침대에 안전하게 놓습니다. 식염수를 눈에 바르고 눈 표면의 부스러기나 털을 헹굽니다.
2. 이가 없는 집게를 사용하여 한쪽 눈을 부드럽게 내민다.
   참고: 실험에서는 마우스의 왼쪽 또는 오른쪽 눈 중 하나를 사용하지만 동일한 마우스에 두 눈을 모두 사용하지는 않습니다.
3. 주입 라인을 닫은 상태에서 변두리에서 약 2mm 떨어진 곳에 바늘로 전방을 캐뉼레이션합니다. 바늘이 각막을 말초의 구부러진 각막 표면에 수직으로 뚫고 홍채 평면과 평행하게 약간 평평해지도록 합니다. 각막은 바늘을 전진시키고 눈 조절을 유지하기 위해 조작될 수 있습니다. 홍채나 수정체에 부딪혀 각막 상처가 커지면 각막이 새어 나올 수 있습니다. 자세한 내용은 Buchi et ^al.2에 의해 자세히 설명되어 있습니다.

7. 허혈기

1. 마개를 돌려 주입 라인을 실행합니다. 각막 상처를 통해 누출이 없는지 확인합니다. 안압이 증가함에 따라 각막이 점진적으로 팽창하는지 확인하십시오.
   알림: 각막이 팽창할 때 심각한 누출이 밀봉되지 않으면 적절한 압력이 유지되지 않으며 절차는 다른 마우스에서 이루어져야 합니다.
2. 안압계로 안압이 90-100mmHg로 상승했는지 확인합니다. 주입 라인을 테이프로 고정하고 바늘이 위치를 바꾸어 누출을 시작하지 않도록 조심스럽게 확인합니다.
3. 바시트라신과 같은 안과 연고를 관류된 눈에 바르면 건조함을 방지할 수 있습니다. 마우스를 현미경에서 멀리 떨어진 곳에 놓고 난방 아래에 놓습니다.amp 정상 체온을 유지하고 다음 60분 동안 모니터링합니다.
4. 시술이 끝나기 30분 전에 안압을 다시 측정하여 안압이 90-100mmHg 사이인지 확인합니다.

8. 재관류 단계

1. 60분 후 마우스를 현미경으로 되돌립니다. 식염수 병을 마우스 높이로 가져와 안압을 정상화합니다.
2. 안압계로 안압을 측정하여 정상인 20mmHg에 가까운지 확인합니다. 안압이 정상화되면 렌즈나 홍채가 손상되지 않도록 조심스럽게 바늘을 제거합니다.

9. 수술 후 관리

1. 바시트라신 수의학 안과 연고와 같은 안과 항균 연고로 쥐의 눈을 코팅합니다.
2. 마취에서 완전히 회복될 때까지 가열된 표면에서 1-2시간 동안 마우스를 모니터링합니다. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복되면 쥐를 우리와 집으로 되돌립니다.

10. 눈 적출³

1. 먼저 케타민 100mg/kg과 자일라진 10mg/kg의 혼합물을 복강내로 주사하여 마우스를 마취한 다음 자궁경부 탈구를 통해 안락사시킵니다.
2. 안락사된 마우스를 평평하고 건조하며 매끄러운 표면에 놓습니다. 식염수 몇 방울로 눈을 헹굽니다.
3. 안구가 소켓에서 이동하고 시신경에 접근할 수 있을 때까지 겸자로 측면 안각에 부드러운 압력을 가합니다. 웨스트콧 가위를 사용하여 안와 가장자리를 따라 잘라 안구 외 근육을 절단합니다.
4. Westcott 가위를 안와의 가장 뒤쪽에 놓고 시신경을 절단합니다.

11. 샘플 고정⁴

1. 적출된 눈을 밀봉된 바이알에 0.1M PBS의 4% 파라포름알데히드에 넣습니다. 3일 후 눈을 제거하고 70% 에탄올 용액이 담긴 바이알에 넣고 하룻밤 보관합니다.
2. 눈을 제거하고 95% 에탄올 용액이 담긴 바이알에 넣습니다. 그런 다음 바이알을 밀봉된 진공 청소기에 15분 동안 넣고 진공 상태에서 제거한 다음 45분 동안 실내 공기에 그대로 둡니다.
3. 진공 과정을 반복하여 100% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌 용액 및 100% 자일렌 용액에 눈을 순차적으로 넣습니다.
4. 눈을 제거하고 깨끗하고 빈 바이알에 넣습니다. 바이알에 60°C의 액화 파라핀을 채웁니다. 바이알을 밀봉된 60°C 진공 오븐에 30분 동안 넣은 다음 진공 없이 30°C 오븐에 60분 동안 넣습니다.
5. 눈을 제거하고 깨끗하고 빈 바이알에 넣고 60°C의 액화 파라핀을 채웁니다. 바이알을 60°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

12. 샘플 임베딩

1. 눈을 금속 임베딩 몰드로 옮기고 60°C 핫플레이트에 액화 파라핀으로 몰드를 채우고 광학 디스크를 통해 절편을 만들기 위해 원하는 방향으로 눈의 방향을 잡습니다. 금형을 실온(RT)에서 식힌 다음 4°C에서 보관하십시오.

13. 샘플 단면화⁵

1. 삽입된 표본을 마이크로톰으로 옮깁니다. 눈에 닿을 때까지 블록을 천천히 자르고 섹션에 광학 디스크가 포함됩니다.
2. 단면을 5μm 두께의 리본으로 자르고 수조에 띄웁니다. 집게를 사용하여 파라핀 리본을 조심스럽게 들어 올리고 세 부분으로 된 리본을 슬라이드에 놓고 밤새 말리십시오.
3. 각 눈에 대해 최소 8개의 슬라이드가 있고 절편이 광학 디스크 중앙에 있을 때까지 이 과정을 반복합니다.

14. 단면도 염색⁵

1. 파라핀을 녹이기 위해 60 °C 오븐에서 슬라이드를 1시간 동안 가열합니다. 슬라이드를 RT 자일렌에 각각 5분씩 세 번 담급니다.
2. 슬라이드를 100% 에탄올에 각각 3분씩 세 번 담급니다. 단면을 수돗물로 1분 동안 헹굽니다.
3. hematoxylin stain에서 절편을 45초 동안 배양합니다. 단면을 수돗물로 2분 동안 헹굽니다.
4. Bluing 시약의 절편을 1분 동안 배양합니다. 단면을 수돗물로 1분 동안 헹굽니다.
5. eosin에서 절편을 15초 동안 배양합니다.
6. 95% 및 100% 에탄올로 섹션을 각각 1분 동안 두 번 헹굽니다. 100% 자일렌으로 각 부분을 1분씩 4번 헹굽니다. 그런 다음 장착 미디어로 슬라이드를 장착합니다.

15. 조직학적 분석⁶

1. 현미경으로 각 망막 단면을 분석하고 망막 주름의 수, 다양한 망막층(신경절 세포층, 내부 핵층, 외부 핵층)의 세포 손실 비율, 유리체 또는 망막하 출혈의 존재 여부, 망막 색소 상피 손상 정도를 기록합니다. 채점 기준에 대한 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.

결과

허혈/재관류 후 망막의 병리학을 평가하기 위해 시술 2일 후 한 그룹의 마우스에서, 시술 후 7일 후에 다른 그룹의 마우스에서 눈을 수집했습니다. 적출된 안구는 4% 파라포름알데히드로 고정되고, 파라핀에 삽입되고, 5μm 절편으로 절편화되었다. 절편은 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin, H&E)으로 염색하고 조직학적 검사를 위해 이미지화했습니다(그림 1<...

토론

허혈/재관류 모델은 망막 허혈/재관류 손상의 메커니즘 및 병리학을 연구하기 위한 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이 모델은 망막 허혈/재관류 손상의 병리학을 연구하고 치료 대상을 식별하는 데 유용합니다. 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 문제를 야기할 수 있으며 성공적으로 완료하려면 기술적 능력이 필요할 수 있습니다. 하나는 실제 캐뉼레이션으로, 마스터?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401