マウス眼モデルにおける網膜虚血-再灌流障害の誘導

要約

このプロトコルは、前房カニューレ挿入と眼圧上昇を介して網膜虚血を誘発することにより、マウスの眼の網膜虚血再灌流損傷をモデル化し、続いて眼圧の正常化により再灌流を開始します。

要約

虚血再灌流障害は、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜血管閉塞、およびその他の血管閉塞状態など、さまざまな網膜の病状を引き起こすことが知られています。この原稿では、マウスモデルで虚血再灌流障害を誘導する方法を紹介します。この方法では、生理食塩水リザーバーに取り付けられた前房カニューレ挿入を利用し、静水圧を発生させて眼圧を90〜100mmHgに上昇させました。この方法は、網膜毛細血管の狭窄を効果的に引き起こし、網膜虚血を誘発しました。虚血期の終わり(60分)に、眼圧を正常化(≤20 mmHg)してから、カニューレを前房から取り外して再灌流を開始しました。虚血/再灌流手順の数日後、眼を採取し、組織学的染色のために切片化しました。網膜切片の組織病理学は、網膜損傷の8つのパラメータ(襞、出血、変形、神経節細胞の細胞喪失、内核、外核、および視細胞受容細胞の喪失、および網膜色素上皮細胞の損傷)を評価することによって採点されました。この方法は、網膜虚血/再灌流損傷のメカニズムと病理を研究するための再現可能なモデルを提供しました。さらに、このモデルは、網膜虚血/再灌流障害を治療するための潜在的な治療標的の発見を促進し、網膜の病状の研究を前進させ、患者の転帰を改善することができます。

概要

虚血/再灌流障害は、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜血管閉塞、および関連する血管閉塞状態を含む、さまざまな網膜病変に現れます。網膜は酸素要求量が高いため、特に虚血/再灌流障害にかかりやすく、この現象は糖尿病性網膜症などの疾患の病因に関与するとされています。この形態の損傷は、網膜神経節細胞(RGC)の死、網膜の形態学的変性、網膜機能の低下、および最終的には視力障害をもたらします¹。虚血/再灌流のモデル化は、虚血/再灌流障害に関連するさまざまな網膜病変のメカニズムと治療反応に関する研究に適しています。

私たちは、マウスの眼における虚血/再灌流障害のモデルの改良に焦点を当てました。圧力誘発性網膜虚血損傷の前房カニューレ挿入モデルは、1991 年に Büchi らによって最初に発表されました²。彼らは、制御された時間、眼圧を110mmHgに上昇させることに成功しました。その結果、得られた網膜損傷は、網膜および脈絡膜血管閉塞と同様の所見と一致していることが分かった。その比較的単純な方法論と費用対効果の高い実行により、網膜虚血性損傷の研究のための機能モデルになりました。針を抜く前に、輸液源をマウスのレベルまで下げるという追加のステップを追加しました。これにより、針を抜いたときに眼内に圧力差が上昇する可能性がなくなり、虚血/再灌流とは無関係の眼内損傷を引き起こしました。

その目的は、眼への処置的損傷を最小限に抑えながら、マウスモデルで網膜虚血/再灌流損傷のメカニズムと病理を研究するための制御された複製可能なモデルを作成することでした。このモデルは、潜在的な治療法を特定し、血管閉塞に関連する網膜の病状の理解を深める方法を提供します。

プロトコル

すべての手順は、ボストン大学施設の動物管理および使用委員会がNIHの実験動物のケアと使用に関するガイドに従って承認した動物使用プロトコルに従って実施され、眼科および視覚研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明に準拠しています。

1.実験動物

1. 標準条件下でのハウスC57BL/6Jマウス。

2. 必要な溶液と輸液ラインの準備

1. 50 mLシリンジに、滅菌した0.9% NaCl生理食塩水をマウス1匹につき1本ずつ充填します。シリンジをベンチ面の高さから120cmの高さに置きます。
2. 充填したシリンジを輸液ラインとストップコックに接続し、ラインの端に30Gの針を取り付けます。ラインからすべての気泡を洗い流します。

3. ワークスペースの準備

1. 生理食塩水ボトルの下に外科/解剖顕微鏡を設置します。
2. 手術中にマウスを安定させるためのベッドを作るには、スポンジで約6cm×3cmのくぼみを切り取り、発泡スチロールのウェルなどの平らな容器にしっかりと入れます。

4.マウスの麻酔

1. ケタミンとキシラジンの標準的な混合物でマウスに麻酔をかけ、深部麻酔を実現します。
   注:このプロトコルでは、ケタミン100 mg / kgとキシラジン10 mg / kgの混合物を腹腔内に注射して、適切な麻酔深度を達成しました。
2. つま先をつまんでも足が引っ込められず、角膜に優しく触れたときにまばたき反射がない場合は、適切な麻酔を行います。麻酔中にマウスが過呼吸や手足の動きなどの痛みの兆候を示した場合は、追加の麻酔を投与します。

5.虹彩の拡張

1. 灌流する目の虹彩を1%トロピカミド1滴で拡張します。拡張のために5分を待ちます。バシトラシンなどの眼科用軟膏を灌流しない眼に塗布します。.

6. 前房カニューレ挿入術

1. 麻酔をかけたマウスを顕微鏡下のスポンジベッドにしっかりと置きます。生理食塩水を目に塗布して、目の表面から破片や毛皮を洗い流します。
2. 歯のない鉗子を一対使用し、片方の目を優しく提案します。
   注:実験では、マウスの左目または右目を使用しますが、同じマウスで両方を使用することはありません。
3. 輸液ラインを閉じた状態で、リンバスから約2mmのところに針で前房をカニューレします。針が角膜を末梢の湾曲した角膜表面に対して垂直に突き刺し、次に虹彩の平面と平行にわずかに平らになるようにします。角膜を操作して針を前進させ、目の制御を維持することができます。虹彩や水晶体を叩いたり、角膜の傷口を大きくしたりしないでください。詳細は、Buchi et ^al.2によってさらに説明されています。

7. 虚血期

1. ストップコックを回して輸液ラインを動かします。角膜創部から漏れがないか確認してください。眼圧が上昇するにつれて角膜が徐々に膨張していることを確認します。.
   注:角膜が膨張しても大きな漏れが密閉されない場合、適切な圧力が維持されず、手順は別のマウスで行う必要があります。.
2. 眼圧計で眼圧が90〜100mmHgに上昇していることを確認します。輸液ラインをテープで固定し、針の位置が変わって漏れ始めないように注意深く確認します。
3. 灌流した眼にバシトラシンなどの眼科用軟膏を塗布し、乾燥を防ぎます。マウスを顕微鏡から離し、加熱ランプの下に置き、正常な体温を維持し、次の60分間監視します。
4. 手順が終了する30分前に眼圧を再測定して、眼圧が90〜100mmHgであることを確認します。

8.再灌流フェーズ

1. 60分後、マウスを顕微鏡に戻します。生理食塩水ボトルをマウスのレベルまで下げ、眼圧を正常化します。
2. 眼圧測定で眼圧を測定し、正常に近い 20 mmHg であることを確認します。眼圧が正常化されたら、レンズや虹彩の損傷を避けて、針を慎重に取り外します。

9. 術後のケア

1. バシトラシン獣医眼科用軟膏などの眼科用抗菌軟膏でマウスの目をコーティングします。
2. マウスが麻酔から完全に回復するまで、加熱された表面でマウスを1〜2時間監視します。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。完全に回復したら、マウスをケージとハウジングに戻します。

10.目の核を摘出する³

1. 最初にケタミン 100 mg/kg とキシラジン 10 mg/kg の混合物を腹腔内に注射してマウスに麻酔をかけ、次に頸部脱臼で安楽死させます。
2. 安楽死させたマウスを平らで乾燥した滑らかな表面に置きます。数滴の生理食塩水で目を洗い流します。
3. 眼球がソケットから移動し、視神経にアクセスできるようになるまで、鉗子で外側眼角に穏やかな圧力をかけます。ウェストコットハサミを使用して、眼窩縁に沿って切断し、外眼筋を切断します。
4. ウェストコットハサミを眼窩の最も後方に配置し、視神経を切断します。

11. サンプルの固定⁴

1. 除核した眼球を、密封されたバイアル中の0.1 M PBS中の4%パラホルムアルデヒドに入れます。3日後、目を取り出し、70%エタノール溶液のバイアルに入れ、一晩保管します。
2. 目を取り外し、95%エタノール溶液のバイアルに入れます。次に、バイアルを密閉された真空に15分間置き、真空から取り出し、室内の空気に45分間放置します。
3. 真空プロセスを繰り返し、目を100%エタノール、100%エタノール、100%キシレン溶液、および100%キシレン溶液に順次配置します。
4. 目を取り外し、清潔で空のバイアルに入れます。バイアルに60°Cの液体化パラフィンを入れます。バイアルを密閉された60°C真空オーブンに30分間入れ、次に真空なしで60°Cオーブンに30分間入れます。
5. 眼球を取り出し、清潔な空のバイアルに入れ、60°Cの液体化パラフィンを充填します。バイアルを60°Cで一晩保管します。

12. サンプルの埋め込み

1. 眼球を金属埋め込み型に移し、60°Cのホットプレート上に液体化パラフィンを型に充填し、視眼鏡板を通る切片を作るために眼球を目的の方向に向けます。金型を室温(RT)で冷ましてから、4°Cで保管します。

13. 試料の切片化⁵

1. 埋め込まれた標本をミクロトームに移します。目が届き、セクションに視神経ディスクが含まれるまで、ブロックをゆっくりとトリミングします。
2. 切片を5μmの厚さのリボン状に切り取り、水浴に浮かべます。鉗子を使用してパラフィンリボンを慎重に持ち上げ、3つのセクションのリボンをスライドに置き、一晩乾かします。
3. 各眼に少なくとも8枚のスライドがあり、セクションが視神経乳頭の中心に配置されるまで、このプロセスを繰り返します。

14. 切片の染色⁵

1. スライドを60°Cのオーブンで1時間加熱し、パラフィンを溶かします。スライドをRTキシレンに3回、それぞれ5分間浸します。
2. スライドを100%エタノールに3回、それぞれ3分間浸します。切片を水道水で1分間すすぎます。
3. 切片をヘマトキシリン染色液中で45秒間インキュベートします。切片を水道水で2分間すすぎます。
4. Bluing試薬の切片を1分間インキュベートします。切片を水道水で1分間すすぎます。
5. 切片をエオシンで15秒間インキュベートします。
6. 切片を95%エタノールと100%エタノールでそれぞれ1分間2回すすぎます。切片を100%キシレンで4回、それぞれ1分間すすぎます。次に、封入剤でスライドをマウントします。

15. 組織学的解析⁶

1. 顕微鏡下で各網膜切片を分析し、網膜のひだの数、さまざまな網膜層(神経節細胞層、内核層、外核層)の細胞損失の割合、硝子体または網膜下出血の存在、および網膜色素上皮損傷の程度を記録します。採点基準の詳細については、 表1 を参照してください。

結果

虚血/再灌流後の網膜の病理を評価するために、処置の2日後にマウスの1つのグループから、および処置の7日後にマウスの別のグループから眼を採取しました。除核した眼球を4%パラホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに包埋し、5μm切片にスライスした。切片をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色し、組織学的検査のために画像化しました(図1

ディスカッション

虚血/再灌流モデルは、網膜虚血/再灌流障害のメカニズムと病理を研究するための再現性のある方法を提供します。このモデルは、網膜虚血/再灌流障害の病理を研究し、治療標的を特定するのに役立ちます。プロトコルのいくつかの重要なステップは、課題を提起し、成功裏に完了するには技術的なスキルが必要になる場合があります。1つは実際のカニューレ挿入?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401