Induktion einer retinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Mausaugenmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll modelliert die retinale Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Mausauge, indem es eine retinale Ischämie über eine Vorderkammerkanülierung und eine Erhöhung des Augeninnendrucks induziert, gefolgt von einer Intraokulardrucknormalisierung, um die Reperfusion zu initiieren.

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass Ischämie-Reperfusionsverletzungen eine Reihe von Netzhauterkrankungen verursachen, darunter diabetische Retinopathie, Glaukom, retinale Gefäßverschlüsse und andere vaso-okklusive Erkrankungen. Dieses Manuskript stellt eine Methode zur Induktion von Ischämie-Reperfusionsschäden in einem Mausmodell vor. Bei der Methode wurde eine Kanülierung der Vorderkammer verwendet, die an einem Kochsalzreservoir befestigt war und einen hydrostatischen Druck erzeugte, um den Augeninnendruck auf 90-100 mmHg zu erhöhen. Diese Methode führte effektiv zu einer Verengung der Netzhautkapillaren, um eine retinale Ischämie zu induzieren. Am Ende der ischämischen Periode (60 min) wurde der Augeninnendruck normalisiert (≤20 mmHg), bevor die Kanüle aus der Vorderkammer entfernt wurde, um die Reperfusion einzuleiten. Tage nach dem Ischämie-/Reperfusionsverfahren wurden die Augen entnommen und für die histologische Färbung geschnitten. Die Histopathologie der Netzhautschnitte wurde bewertet, indem acht Parameter der Netzhautverletzung ausgewertet wurden: Falten, Blutungen, Deformationen, Zellverlust in der Ganglienzelle, in den inneren Kern-, Außenkern- und Photorezeptorschichten sowie Schädigung der retinalen Pigmentepithelzellen. Diese Methode lieferte ein reproduzierbares Modell, um die Mechanismen und die Pathologie der retinalen Ischämie/Reperfusionsverletzung zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses Modell die Entdeckung potenzieller therapeutischer Ziele zur Behandlung von retinaler Ischämie/Reperfusionsschäden erleichtern, die Erforschung von Netzhauterkrankungen vorantreiben und die Patientenergebnisse verbessern.

Einleitung

Ischämie-/Reperfusionsverletzungen manifestieren sich in verschiedenen Netzhauterkrankungen, darunter diabetische Retinopathie, Glaukom, retinale Gefäßverschlüsse und verwandte vaso-okklusive Erkrankungen. Aufgrund des hohen Sauerstoffbedarfs der Netzhaut ist sie besonders anfällig für Ischämie/Reperfusionsschäden, ein Phänomen, das mit der Pathogenese von Krankheiten wie der diabetischen Retinopathie in Verbindung gebracht wird. Diese Form der Verletzung führt zum Absterben der retinalen Ganglienzellen (RGCs), zur morphologischen Degeneration der Netzhaut, zu einer Beeinträchtigung der Netzhautfunktion und schließlich zu einer Beeinträchtigung des Sehvermögens¹. Die Modellierung der Ischämie/Reperfusion eignet sich für Studien zu Mechanismen und Behandlungsreaktionen bei verschiedenen Netzhautpathologien im Zusammenhang mit Ischämie-/Reperfusionsverletzungen.

Wir konzentrierten uns auf die Verfeinerung eines Modells für Ischämie/Reperfusionsverletzungen im Mausauge. Das Vorderkammer-Kanülenmodell für druckinduzierte retinale Ischämie-Verletzungen wurde erstmals 1991 von Büchi et al. veröffentlicht². Es gelang ihnen, den Augeninnendruck für eine kontrollierte Zeit auf 110 mmHg zu erhöhen. Sie fanden heraus, dass die daraus resultierende Netzhautverletzung mit Befunden übereinstimmte, die einem retinalen und choroidalen Gefäßverschluss ähneln. Aufgrund seiner relativ einfachen Methodik und kostengünstigen Ausführung wurde es zu einem Funktionsmodell für die Untersuchung von ischämischen Netzhautverletzungen. Wir fügten den zusätzlichen Schritt hinzu, die Infusionsquelle vor dem Zurückziehen der Nadel auf das Niveau der Maus abzusenken. Dies verhinderte, dass sich beim Entfernen der Nadel eine mögliche erhöhte Druckdifferenz im Auge bildete, die zu intraokularen Schäden führte, die nicht mit der Ischämie/Reperfusion zusammenhingen.

Ziel war es, ein kontrolliertes und replizierbares Modell zur Erforschung der Mechanismen und der Pathologie der retinalen Ischämie/Reperfusionsverletzung in einem Mausmodell zu erstellen und gleichzeitig die prozedurale Schädigung des Auges zu minimieren. Dieses Modell bietet eine Möglichkeit, potenzielle Behandlungen zu identifizieren und unser Verständnis von Netzhauterkrankungen, die mit Gefäßverschlüssen verbunden sind, zu verbessern.

Protokoll

Alle Verfahren wurden gemäß einem Tierverwendungsprotokoll durchgeführt, das vom Boston University Institutional Animal Care and Use Committee gemäß dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigt wurde, und entspricht der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.

1. Versuchstiere

1. Haltung von C57BL/6J-Mäusen unter Standardbedingungen.

2. Vorbereiten der erforderlichen Lösung und Infusionsleitung

1. In einer 50-ml-Spritze eine pro Maus mit sterilisierter 0,9%iger NaCl-Kochsalzlösung auffüllen. Platzieren Sie die Spritze in einer Höhe von 120 cm über dem Niveau der Bankoberfläche.
2. Verbinden Sie die gefüllte Spritze mit einer Infusionsleitung und einem Absperrhahn, an dessen Ende eine 30-G-Nadel befestigt ist. Spülen Sie alle Luftblasen aus der Leitung aus.

3. Vorbereiten des Arbeitsbereichs

1. Stellen Sie ein Operations-/Präpariermikroskop unter der Kochsalzflasche auf.
2. Erstellen Sie ein Bett, um die Maus während des Eingriffs zu stabilisieren, indem Sie eine Vertiefung von ca. 6 cm x 3 cm in einen Schwamm schneiden und sicher in eine Styroporwanne oder einen anderen flachen Behälter legen.

4. Betäubung der Maus

1. Betäuben Sie die Maus mit einer Standardmischung aus Ketamin und Xylazin auf einem Niveau, um eine tiefe Anästhesie zu erreichen.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde eine Mischung aus Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg intraperitoneal injiziert, um eine angemessene Anästhesietiefe zu erreichen.
2. Erreichen Sie eine adäquate Anästhesie, wenn es kein Zurückziehen der Pfote als Reaktion auf ein Einklemmen der Zehen und keinen Blinzelreflex gibt, wenn die Hornhaut sanft berührt wird. Verabreichen Sie eine zusätzliche Anästhesie, wenn die Maus während der Narkose Anzeichen von Schmerzen zeigt, wie z. B. Hyperventilieren oder Bewegungen der Gliedmaßen.

5. Erweiterung der Iris

1. Erweitern Sie die zu perfundierende Iris des Auges mit 1 Tropfen 1% Tropicamid. Warten Sie 5 Minuten für die Dilatation. Tragen Sie eine Augensalbe wie Bacitracin auf das Auge auf, die nicht durchblutet wird.

6. Kanülierung der Vorderkammer

1. Legen Sie die anästhesierte Maus sicher in das Schwammbett unter dem Mikroskop. Tragen Sie Kochsalzlösung auf die Augen auf, um Schmutz oder Fell von der Augenoberfläche zu spülen.
2. Verwenden Sie eine nicht gezahnte Pinzette und schlagen Sie vorsichtig eines der Augen vor.
   HINWEIS: Bei einem Experiment wird entweder das linke oder das rechte Auge der Maus verwendet, aber niemals beide auf derselben Maus.
3. Bei geschlossenem Infusionsschlauch die Vorderkammer mit der Nadel ca. 2 mm vom Limbus entfernt kanülieren. Stellen Sie sicher, dass die Nadel die Hornhaut senkrecht zur peripheren, gekrümmten Hornhautoberfläche durchsticht und dann parallel zur Ebene der Iris leicht abgeflacht wird. Die Hornhaut kann manipuliert werden, um die Nadel vorzuschieben und die Kontrolle über das Auge zu erhalten. Vermeiden Sie es, die Iris oder die Linse zu treffen und die Hornhautwunde zu vergrößern, da dies zu Undichtigkeiten führen kann. Details werden von Büchi et ^al.2 näher beschrieben.

7. Ischämische Phase

1. Drehen Sie den Absperrhahn, um die Infusionsleitung zu betreiben. Vergewissern Sie sich, dass keine Leckage durch die Hornhautwunde vorhanden ist. Achten Sie darauf, dass sich die Hornhaut mit steigendem Augeninnendruck allmählich ausdehnt.
   HINWEIS: Wenn eine signifikante Leckage nicht abdichtet, wenn sich die Hornhaut ausdehnt, wird kein ausreichender Druck aufrechterhalten, und der Eingriff muss mit einer anderen Maus durchgeführt werden.
2. Überprüfen Sie mit einem Tonometer, ob der Augeninnendruck auf 90-100 mmHg angestiegen ist. Sichern Sie die Infusionsleitung mit Klebeband und stellen Sie sorgfältig sicher, dass sich die Position der Nadel nicht ändert und ausläuft.
3. Tragen Sie eine Augensalbe wie Bacitracin auf das durchblutete Auge auf, um Trockenheit zu verhindern. Legen Sie die Maus vom Mikroskop weg und unter eine Heizlampe, um die normale Körpertemperatur aufrechtzuerhalten und für die nächsten 60 Minuten zu überwachen.
4. Messen Sie den Augeninnendruck 30 Minuten vor Ende des Eingriffs erneut, um sicherzustellen, dass der Augeninnendruck zwischen 90 und 100 mmHg liegt.

8. Phase der Reperfusion

1. Nach 60 Minuten stellen Sie die Maus wieder ins Mikroskop. Bringen Sie die Flasche mit Kochsalzlösung auf die Höhe der Maus und normalisieren Sie den Augeninnendruck.
2. Messen Sie den Augeninnendruck mit der Tonometrie, um zu überprüfen, ob er nahe dem Normalwert von 20 mmHg liegt. Sobald sich der Augeninnendruck normalisiert hat, entfernen Sie die Nadel vorsichtig, um Schäden an der Linse oder der Iris zu vermeiden.

9. Nachsorge

1. Beschichten Sie die Augen der Maus mit einer antibakteriellen Augensalbe, wie z. B. einer veterinärmedizinischen Augensalbe.
2. Überwachen Sie die Maus 1-2 Stunden lang auf einer erhitzten Oberfläche, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Bringen Sie die Mäuse wieder in Käfige und Ställe, sobald sie vollständig genesen sind.

10. Entkernung des Auges³

1. Betäuben Sie die Maus zunächst mit einer Mischung aus Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg, die intraperitoneal injiziert wird, und euthanasieren Sie sie dann über eine Gebärmutterhalsluxation.
2. Positionieren Sie die euthanasierte Maus auf einer flachen, trockenen und glatten Oberfläche. Spülen Sie das Auge mit ein paar Tropfen Kochsalzlösung aus.
3. Üben Sie mit der Pinzette einen sanften Druck auf den lateralen Canthus aus, bis sich der Augapfel aus der Augenhöhle verlagert hat und der Sehnerv zugänglich ist. Schneiden Sie mit einer Westcott-Schere entlang der Augenhöhlenränder, um die extraokulären Muskeln zu durchtrennen.
4. Positionieren Sie die Westcott-Schere an der hintersten Stelle der Augenhöhle und durchtrennen Sie den Sehnerv.

11. Fixieren der Probe⁴

1. Legen Sie das enukleierte Auge in ein verschlossenes Fläschchen in 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M PBS. Entfernen Sie nach 3 Tagen das Auge, legen Sie es in ein Fläschchen mit 70%iger Ethanollösung und lagern Sie es über Nacht.
2. Entfernen Sie die Augen und legen Sie sie in ein Fläschchen mit 95%iger Ethanollösung. Stellen Sie dann das Fläschchen 15 Minuten lang in ein verschlossenes Vakuum, nehmen Sie es aus dem Vakuum und lassen Sie es 45 Minuten lang an der Raumluft.
3. Wiederholen Sie den Vakuumvorgang und legen Sie das Auge nacheinander in die folgenden Lösungen: 100 % Ethanol, 100 % Ethanol, 100 % Xylollösung und 100 % Xylollösung.
4. Entfernen Sie das Auge und legen Sie es in ein sauberes, leeres Fläschchen. Füllen Sie das Fläschchen mit 60 °C flüssigem Paraffin. Stellen Sie das Fläschchen für 30 min in einen verschlossenen 60 °C Vakuumofen und dann 30 min in den 60 °C Ofen ohne Vakuum.
5. Entfernen Sie das Auge, legen Sie es in ein sauberes, leeres Fläschchen und füllen Sie es mit 60 °C verflüssigtem Paraffin. Lagern Sie die Durchstechflasche über Nacht bei 60 °C.

12. Einbetten der Probe

1. Übertragen Sie das Auge in eine Metalleinbettungsform und füllen Sie die Form mit flüssigem Paraffin auf einer 60 °C heißen Platte, wobei Sie das Auge in die gewünschte Richtung ausrichten, um Schnitte durch die Papille zu machen. Lassen Sie die Form bei Raumtemperatur (RT) abkühlen und lagern Sie sie dann bei 4 °C.

13. Schneiden der Probe⁵

1. Übertragen Sie die eingebetteten Proben auf das Mikrotom. Schneiden Sie den Block langsam ab, bis das Auge erreicht ist und die Abschnitte die Sehscheibe enthalten.
2. Schneiden Sie die Abschnitte als Bänder von 5 μm Dicke ab und schwimmen Sie sie auf einem Wasserbad. Heben Sie das Paraffinband vorsichtig mit einer Pinzette an, legen Sie dreiteilige Bänder auf einen Objektträger und lassen Sie es über Nacht trocknen.
3. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis mindestens 8 Objektträger für jedes Auge vorhanden sind, deren Abschnitte auf der Papille zentriert sind.

14. Färben der Abschnitte⁵

1. Die Objektträger im 60 °C heißen Backofen 1 h erhitzen, um das Paraffin zu schmelzen. Tauchen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 5 Minuten in RT-Xylol.
2. Tauchen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 3 Minuten in 100% Ethanol. Spülen Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit Leitungswasser ab.
3. Inkubieren Sie die Abschnitte 45 s lang in Hämatoxylin-Färbung. Spülen Sie die Abschnitte 2 Minuten lang mit Leitungswasser ab.
4. Inkubieren Sie die Schnitte 1 Min. lang im Bläuereagenz. Spülen Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit Leitungswasser ab.
5. Inkubieren Sie die Abschnitte 15 s lang in Eosin.
6. Spülen Sie die Abschnitte zweimal für jeweils 1 Minute in 95% und 100% Ethanol. Spülen Sie die Abschnitte viermal zu je 1 Minute mit 100% Xylol ab. Montieren Sie dann die Dias mit Montagemedien.

15. Histologische Analyse⁶

1. Analysieren Sie jeden Netzhautschnitt unter dem Mikroskop und erfassen Sie die Anzahl der Netzhautfalten, den prozentualen Zellverlust in den verschiedenen Netzhautschichten (Ganglienzellschicht, innere Kernschicht, äußere Kernschicht), das Vorhandensein von glasartigen oder subretinalen Blutungen und das Ausmaß der Schädigung des retinalen Pigmentepithels. Einzelheiten zu den Bewertungskriterien finden Sie in Tabelle 1 .

Ergebnisse

Um die Pathologie der Netzhaut nach der Ischämie/Reperfusion zu beurteilen, wurden 2 Tage nach dem Eingriff von einer Gruppe von Mäusen und 7 Tage nach dem Eingriff von einer anderen Gruppe von Mäusen Augen entnommen. Die enukleierten Augen wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5 μm große Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt und für die histologische Untersuchung abgebildet (Abbildung...

Diskussion

Das Ischämie/Reperfusionsmodell bietet eine reproduzierbare Methode zur Untersuchung der Mechanismen und der Pathologie der retinalen Ischämie/Reperfusionsverletzung. Dieses Modell ist nützlich bei der Untersuchung der Pathologie der retinalen Ischämie/Reperfusionsverletzung und bei der Identifizierung therapeutischer Ziele. Mehrere kritische Schritte im Protokoll können eine Herausforderung darstellen und erfordern technische Fähigkeiten, um erfolgreich abgeschlossen zu werden. Ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401