Bir Fare Gözü Modelinde Retinal İskemi-Reperfüzyon Hasarının İndüksiyonu

Özet

Bu protokol, ön kamara kanülasyonu ve göz içi basınç yükselmesi yoluyla retina iskemiyi indükleyerek ve ardından reperfüzyonu başlatmak için göz içi basıncı normalizasyonu ile bir fare gözünde retinal iskemi-reperfüzyon hasarını modeller.

Özet

İskemi-reperfüzyon yaralanmalarının diyabetik retinopati, glokom, retinal vasküler tıkanıklıklar ve diğer vazo-tıkayıcı durumlar dahil olmak üzere bir dizi retinal patolojiye neden olduğu bilinmektedir. Bu makale, bir fare modelinde iskemi-reperfüzyon hasarını indüklemek için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, göz içi basıncını 90-100 mmHg'ye yükseltmek için hidrostatik basınç üreten bir tuzlu su rezervuarına bağlı ön kamara kanülasyonunu kullandı. Bu yöntem, retina iskemisini indüklemek için retina kılcal damarlarının daralmasına etkili bir şekilde neden oldu. İskemik dönemin sonunda (60 dk), reperfüzyonu başlatmak için kanül ön kamaradan çıkarılmadan önce göz içi basıncı normale (≤20 mmHg) getirildi. İskemi/reperfüzyon işleminden günler sonra gözler toplandı ve histolojik boyama için kesitlere alındı. Retina kesitlerinin histopatolojisi, retina hasarının sekiz parametresi değerlendirilerek skorlandı: kıvrımlar, kanama, deformasyon, ganglion hücresinde hücre kaybı, iç nükleer, dış nükleer ve fotoreseptör tabakaları ve retina pigment epitel hücrelerinde hasar. Bu yöntem, retinal iskemi/reperfüzyon hasarının mekanizmalarını ve patolojisini incelemek için tekrarlanabilir bir model sağlamıştır. Ek olarak, bu model retina iskemisi/reperfüzyon hasarını tedavi etmek için potansiyel terapötik hedeflerin keşfini kolaylaştırabilir, retina patolojilerinin çalışmasını ilerletebilir ve hasta sonuçlarını iyileştirebilir.

Giriş

İskemi/reperfüzyon yaralanmaları, diyabetik retinopati, glokom, retinal vasküler tıkanıklıklar ve ilgili vazo-tıkayıcı durumları kapsayan çeşitli retina patolojilerinde ortaya çıkar. Retinanın yüksek oksijen ihtiyacı göz önüne alındığında, diyabetik retinopati gibi hastalıkların patogenezinde rol oynayan bir fenomen olan iskemi / reperfüzyon hasarına özellikle duyarlıdır. Bu yaralanma şekli, retina ganglion hücrelerinin (RGC'ler) ölümüne, retinanın morfolojik dejenerasyonuna, retina fonksiyonunun bozulmasına ve nihayetinde görme bozukluğuna neden olur¹. İskemi/reperfüzyon yaralanmalarına bağlı çeşitli retinal patolojilerde mekanizmalar ve tedavi yanıtları üzerine yapılan çalışmalar için iskemi/reperfüzyonun modellenmesi uygundur.

Fare gözünde iskemi/reperfüzyon hasarı için bir model geliştirmeye odaklandık. Basınca bağlı retinal iskemi hasarı için ön kamara kanülasyon modeli ilk olarak 1991 yılında Büchi ve ark. tarafından yayınlanmıştır². Göz içi basıncını kontrollü bir süre için başarılı bir şekilde 110 mmHg'ye yükselttiler. Ortaya çıkan retina hasarının, retina ve koroid damar tıkanıklığına benzer bulgularla tutarlı olduğunu buldular. Nispeten basit metodolojisi ve uygun maliyetli uygulaması nedeniyle, retinal iskemik yaralanma çalışması için fonksiyonel bir model haline geldi. İğneyi geri çekmeden önce infüzyon kaynağını farenin seviyesine düşürmek için ek bir adım ekledik. Bu, iğne çıkarıldığında göz içinde olası bir yüksek basınç farkının oluşmasını önledi ve iskemi / reperfüzyonla ilgisi olmayan göz içi hasarına neden oldu.

Amaç, bir fare modelinde retinal iskemi / reperfüzyon hasarının mekanizmalarını ve patolojisini araştırmak için kontrollü ve tekrarlanabilir bir model oluşturmak ve gözdeki prosedürel hasarı en aza indirmekti. Bu model, potansiyel tedavileri belirlemek ve vasküler tıkanıklık ile ilişkili retina patolojilerini anlamamızı geliştirmek için bir yol sunar.

Protokol

Tüm prosedürler, Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre onaylanan bir hayvan kullanım protokolüne göre gerçekleştirilmiştir ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) hayvanların oftalmik ve görme araştırmalarında kullanımına ilişkin beyanına uygundur.

1. Deney hayvanları

1. Standart koşullar altında C57BL/6J fareleri barındırın.

2. Gerekli çözelti ve infüzyon hattının hazırlanması

1. 50 mL'lik bir şırıngada, fare başına bir tane olmak üzere sterilize edilmiş% 0.9 NaCl salin solüsyonu ile doldurun. Şırıngayı tezgah yüzeyinin seviyesinden 120 cm yüksekliğe yerleştirin.
2. Doldurulmuş şırıngayı bir infüzyon hattına ve hattın ucuna bağlı 30 G'lik bir iğne ile bir musluk bağlayın. Hattaki tüm hava kabarcıklarını boşaltın.

3. Çalışma alanının hazırlanması

1. Salin şişesinin altına bir cerrahi/diseksiyon mikroskobu yerleştirin.
2. Bir süngerde yaklaşık 6 cm x 3 cm'lik bir çöküntü keserek ve bir strafor kuyusuna veya başka bir düz kaba güvenli bir şekilde yerleştirerek işlem sırasında fareyi stabilize etmek için bir yatak oluşturun.

4. Fareyi uyuşturmak

1. Fareyi, derin anestezik elde etmek için standart bir ketamin ve ksilazin karışımı ile uyuşturun.
   NOT: Bu protokolde yeterli anestezi derinliğini sağlamak için ketamin 100 mg/kg ve ksilazin 10 mg/kg karışımı intraperitoneal olarak enjekte edildi.
2. Ayak parmağı sıkışmasına yanıt olarak pençe çekilmesi olmadığında ve korneaya hafifçe dokunulduğunda göz kırpma refleksi olmadığında yeterli anestezi sağlayın. Fare anestezi altındayken hiperventilasyon veya uzuv hareketi gibi herhangi bir ağrı belirtisi gösteriyorsa ek anestezi uygulayın.

5. İrisin genişletilmesi

1. 1 damla% 1 tropikamid ile perfüze edilecek gözün irisini genişletin. Genişleme için 5 dakika bekleyin. Göze perfüze edilmeyecek basitrasin gibi bir oftalmik merhem sürün.

6. Ön kamara kanülasyonu

1. Anestezi uygulanmış fareyi mikroskop altındaki sünger yatağına güvenli bir şekilde yerleştirin. Göz yüzeyindeki kalıntıları veya kürkleri durulamak için gözlere tuzlu su solüsyonu uygulayın.
2. Bir çift dişli olmayan forseps kullanın ve nazikçe gözlerden birini önerin.
   NOT: Bir deneyde farenin sol veya sağ gözlerinden biri kullanılır, ancak aynı farede hiçbir zaman her ikisi birden kullanılmaz.
3. İnfüzyon hattı kapalıyken, iğne limbustan yaklaşık 2 mm uzakta olacak şekilde ön kamarayı kanüle edin. İğnenin korneayı çevresel, kavisli kornea yüzeyine dik olarak deldiğinden ve ardından iris düzlemine paralel olarak hafifçe düzleştirdiğinden emin olun. Kornea, iğneyi ilerletmek ve göz kontrolünü sağlamak için manipüle edilebilir. İrislere veya lenslere çarpmaktan ve kornea yarasını büyütmekten kaçının, bu sızıntıya neden olabilir. Ayrıntılar Buchi ve ^ark.2 tarafından daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

7. İskemik faz

1. İnfüzyon hattını çalıştırmak için musluğu çevirin. Kornea yarasından sızıntı olmadığını doğrulayın. Göz içi basıncı arttıkça korneada kademeli bir şişkinlik olduğundan emin olun.
   NOT: Kornea şiştikçe önemli bir sızıntı olmazsa, yeterli basınç sağlanamaz ve prosedürün farklı bir farede yapılması gerekir.
2. Bir tonometre ile göz içi basıncının 90-100 mmHg'ye yükseldiğini kontrol edin. İnfüzyon hattını bantla sabitleyin, iğnenin pozisyon değiştirmediğinden ve sızıntıya başlamadığından emin olun.
3. Kuruluğu önlemek için perfüze edilmiş göze basitrasin gibi bir oftalmik merhem sürün. Normal vücut ısısını korumak ve sonraki 60 dakika boyunca izlemek için fareyi mikroskoptan uzağa ve bir ısıtma lambasının altına yerleştirin.
4. Göz içi basıncının 90-100 mmHg arasında olduğundan emin olmak için işlem bitmeden 30 dakika önce göz içi basıncını tekrar ölçün.

8. Reperfüzyon aşaması

1. 60 dakika sonra fareyi mikroskoba geri koyun. Tuzlu su çözeltisi şişesini farenin seviyesine getirin ve göz içi basıncını normalleştirin.
2. Normale yakın olduğunu kontrol etmek için tonometri ile göz içi basıncını ölçün, 20 mmHg. Göz içi basıncı normale döndüğünde, lense veya irise zarar vermekten kaçınarak iğneyi dikkatlice çıkarın.

9. Ameliyat sonrası bakım

1. Fare gözlerini basitrasin veteriner oftalmik merhem gibi herhangi bir oftalmik antibakteriyel merhem ile kaplayın.
2. Anesteziden tamamen iyileşene kadar fareyi ısıtılmış bir yüzeyde 1-2 saat izleyin. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileştikten sonra fareleri kafeslere ve yuvalara geri koyun.

10. Gözün enükleasyonu³

1. Fareyi önce intraperitoneal olarak enjekte edilen 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin karışımı ile uyuşturun ve ardından servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın.
2. Ötenazi uygulanmış fareyi düz, kuru ve pürüzsüz bir yüzeye yerleştirin. Gözünüzü birkaç damla tuzlu su çözeltisi ile durulayın.
3. Göz küresi yuvadan çıkana ve optik sinire erişilene kadar forseps ile lateral kantusa hafif bir baskı uygulayın. Westcott makası kullanarak, göz dışı kasları koparmak için orbital kenarları takip ederek kesin.
4. Westcott makasını göz yuvasının en arka yönüne yerleştirin ve optik siniri kesin.

11. Numunenin sabitlenmesi⁴

1. Enükleasyonlu gözü kapalı bir şişede 0.1 M PBS'de% 4 paraformaldehite yerleştirin. 3 gün sonra gözü çıkarın,% 70 etanol çözeltisi içeren bir şişeye koyun ve gece boyunca saklayın.
2. Gözleri çıkarın ve% 95 etanol çözeltisi içeren bir şişeye yerleştirin. Ardından, şişeyi 15 dakika boyunca kapalı bir vakuma koyun, vakumdan çıkarın ve 45 dakika oda havasında bırakın.
3. Gözü sırayla aşağıdaki solüsyonlara yerleştirerek vakum işlemini tekrarlayın: %100 etanol, %100 etanol, %100 ksilen solüsyonu ve %100 ksilen solüsyonu.
4. Gözü çıkarın ve temiz, boş bir şişeye koyun. Şişeyi 60 °C sıvılaştırılmış parafin ile doldurun. Şişeyi kapalı bir 60 °C vakumlu fırına 30 dakika ve ardından 30 dakika vakumsuz 60 °C fırına koyun.
5. Gözü çıkarın, temiz, boş bir şişeye koyun ve 60 °C sıvılaştırılmış parafin ile doldurun. Şişeyi gece boyunca 60 °C'de saklayın.

12. Numuneyi gömme

1. Gözü metal bir gömme kalıbına aktarın ve kalıbı 60 °C'lik bir ocak gözü üzerinde sıvılaştırılmış parafin ile doldurun, optik diskten kesitler oluşturmak için gözü istenen yöne yönlendirin. Kalıbın oda sıcaklığında (RT) soğumasını bekleyin, ardından 4 °C'de saklayın.

13. Numunenin bölümlere ayrılması⁵

1. Gömülü örnekleri mikrotoma aktarın. Göze ulaşılana ve bölümler optik diski içerene kadar bloğu yavaşça kesin.
2. Kesitleri 5 μm kalınlığında şeritler halinde kesin ve bir su banyosunda yüzdürün. Parafin şeridini forseps kullanarak dikkatlice kaldırın, üç bölümden oluşan şeritleri bir slayt üzerine yerleştirin ve gece boyunca kurumaya bırakın.
3. Optik disk üzerinde ortalanmış bölümler ile her göz için en az 8 slayt olana kadar bu işlemi tekrarlayın.

14. Bölümlerin boyanması⁵

1. Parafini eritmek için slaytları 60 °C fırında 1 saat ısıtın. Slaytları her biri 5 dakika boyunca üç kez RT ksilene batırın.
2. Slaytları her biri 3 dakika boyunca üç kez %100 etanole batırın. Bölümleri musluk suyunda 1 dakika durulayın.
3. Hematoksilen boyasındaki bölümleri 45 saniye inkübe edin. Bölümleri musluk suyunda 2 dakika durulayın.
4. Bluing reaktifindeki bölümleri 1 dakika inkübe edin. Bölümleri musluk suyunda 1 dakika durulayın.
5. Bölümleri eozin içinde 15 saniye inkübe edin.
6. Bölümleri %95 ve %100 etanolde her biri 1 dakika boyunca iki kez durulayın. Bölümleri %100 ksilen içinde her biri 1 dakika olmak üzere dört kez durulayın. Ardından, kızakları montaj ortamıyla monte edin.

15. Histolojik analiz⁶

1. Her retina bölümünü mikroskop altında analiz edin ve retina kıvrımlarının sayısını, çeşitli retina katmanlarındaki (ganglion hücre katmanı, iç nükleer katman, dış nükleer katman) hücre kaybı yüzdesini, vitreus veya subretinal kanamanın varlığını ve retina pigmenti epitel hasarının derecesini kaydedin. Puanlama kriterleriyle ilgili ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.

Sonuçlar

İskemi / reperfüzyon sonrası retinaların patolojisini değerlendirmek için, işlemden 2 gün sonra bir grup fareden ve işlemden 7 gün sonra başka bir fare grubundan gözler toplandı. Enükleasyonlu gözler %4'lük paraformaldehit içine sabitlendi, parafine gömüldü ve 5 μm'lik bölümlere dilimlendi. Kesitler hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyandı ve histolojik inceleme için görüntülendi (Şekil 1). Boyanmış histolojik görüntüler, I/R...

Tartışmalar

İskemi/reperfüzyon modeli, retinal iskemi/reperfüzyon hasarının mekanizmalarını ve patolojisini incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu model, retinal iskemi / reperfüzyon hasarının patolojisini incelemede ve terapötik hedefleri belirlemede yararlıdır. Protokoldeki birkaç kritik adım zorluklar doğurabilir ve başarılı bir şekilde tamamlanması için teknik beceriler gerektirebilir. Birincisi, ustalaşmak için birden fazla deneme yapabilen ve gözdeki d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401