אינדוקציה של פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה ברשתית במודל עין עכבר

Summary

פרוטוקול זה מדגמן פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה ברשתית בעין עכבר על ידי השראת איסכמיה ברשתית באמצעות צינורית החדר הקדמי והעלאת הלחץ התוך עיני, ולאחר מכן נורמליזציה של לחץ תוך עיני כדי להתחיל את הרפרפוזיה.

Abstract

ידוע כי פגיעות איסכמיה-רפרפוזיה גורמות למגוון פתולוגיות רשתית, כולל רטינופתיה סוכרתית, גלאוקומה, חסימות כלי דם ברשתית ומצבים אחרים של חסימת כלי דם. כתב יד זה מציג שיטה לגרימת פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה במודל עכבר. השיטה השתמשה בקנולציה של החדר הקדמי המחוברת למאגר מי מלח, ויצרה לחץ הידרוסטטי כדי להעלות את הלחץ התוך עיני ל-90-100 מ"מ כספית. שיטה זו גרמה למעשה להתכווצות נימי הרשתית כדי לגרום לאיסכמיה ברשתית. בתום התקופה האיסכמית (60 דקות), הלחץ התוך עיני נורמל (≤20 מ"מ כספית) לפני הוצאת הצינורית מהחדר הקדמי כדי ליזום רפרפוזיה. ימים לאחר הליך איסכמיה/רפרפוזיה, העיניים נאספו ונחתכו לצביעה היסטולוגית. ההיסטופתולוגיה של קטעי הרשתית ניקדה על ידי הערכת שמונה פרמטרים של פגיעה ברשתית: קפלים, דימום, דפורמציה, אובדן תאים בתא הגנגליון, שכבות הגרעין הפנימיות, הגרעין החיצוני וקולטני האור, ונזק לתאי אפיתל פיגמנט הרשתית. שיטה זו סיפקה מודל ניתן לשחזור לחקר המנגנונים והפתולוגיה של איסכמיה ברשתית/פגיעה ברפרפוזיה. בנוסף, מודל זה יכול להקל על גילוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול באיסכמיה ברשתית/פגיעה ברפרפוזיה, לקדם את חקר הפתולוגיות ברשתית ולשפר את תוצאות המטופלים.

Introduction

פגיעות איסכמיה/רפרפוזיה מתבטאות בפתולוגיות שונות של הרשתית, הכוללות רטינופתיה סוכרתית, גלאוקומה, חסימות כלי דם ברשתית ומצבים קשורים לחסימת כלי דם. בהתחשב בדרישת החמצן הגבוהה של הרשתית, היא רגישה במיוחד לפגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה, תופעה המעורבת בפתוגנזה של מחלות כמו רטינופתיה סוכרתית. צורה זו של פגיעה גורמת למוות של תאי גנגליון ברשתית (RGCs), ניוון מורפולוגי של הרשתית, פגיעה בתפקוד הרשתית ובסופו של דבר ליקוי ראייה¹. מידול האיסכמיה/רפרפוזיה מתאים למחקרים על מנגנונים ותגובות טיפול בפתולוגיות רשתית שונות הקשורות לפגיעות איסכמיה/רפרפוזיה.

התמקדנו בחידוד מודל לפגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה בעין העכבר. מודל הקנולציה של החדר הקדמי לפגיעה באיסכמיה ברשתית הנגרמת על ידי לחץ פורסם לראשונה על ידי Büchi et al. בשנת 1991². הם הגדילו בהצלחה את הלחץ התוך עיני ל-110 מ"מ כספית למשך זמן מבוקר. הם מצאו כי הפגיעה ברשתית כתוצאה מכך הייתה עקבית עם ממצאים דומים לחסימת כלי דם ברשתית ובכורואידל. בשל המתודולוגיה הפשוטה יחסית והביצוע החסכוני שלו, הוא הפך למודל פונקציונלי לחקר פגיעה איסכמית ברשתית. הוספנו את השלב הנוסף של הורדת מקור העירוי לרמת העכבר לפני הוצאת המחט. זה מנע היווצרות הפרש לחץ מוגבר אפשרי בתוך העין בעת הסרת המחט, מה שגרם לנזק תוך עיני שאינו קשור לאיסכמיה/רפרפוזיה.

המטרה הייתה ליצור מודל מבוקר וניתן לשכפול לחקר המנגנונים והפתולוגיה של איסכמיה ברשתית/פגיעה ברפרפוזיה במודל עכברי תוך מזעור נזק פרוצדורלי לעין. מודל זה מציע דרך לזהות טיפולים פוטנציאליים ולשפר את ההבנה שלנו לגבי פתולוגיות רשתית הקשורות לחסימת כלי דם.

Protocol

כל ההליכים בוצעו על פי פרוטוקול שימוש בבעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת בוסטון על פי מדריך ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ותואם את הצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.

1. חיות ניסוי

1. עכברי בית C57BL/6J בתנאים סטנדרטיים.

2. הכנת התמיסה הנדרשת וקו העירוי

1. במזרק של 50 מ"ל, מלאו בתמיסת מלח מעוקרת של 0.9% NaCl באחד לכל עכבר. הניחו את המזרק בגובה 120 ס"מ מעל מפלס משטח הספסל.
2. חבר את המזרק המלא לקו עירוי ולתא עצירה עם מחט 30 גרם המחוברת לקצה הקו. שטוף את כל בועות האוויר מהקו.

3. הכנת סביבת העבודה

1. הגדר מיקרוסקופ כירורגי/מנתח מתחת לבקבוק המלח.
2. צור מיטה לייצוב העכבר במהלך ההליך על ידי חיתוך שקע של כ -6 ס"מ על 3 ס"מ בספוג והנחתו היטב בבאר קלקר או במיכל שטוח אחר.

4. הרדמת העכבר

1. להרדים את העכבר בתערובת סטנדרטית של קטמין וקסילזין ברמה כדי להשיג הרדמה עמוקה.
   הערה: בפרוטוקול זה, תערובת של קטמין 100 מ"ג/ק"ג וקסילזין 10 מ"ג/ק"ג הוזרקה תוך צפקית כדי להשיג עומק הרדמה נאות.
2. השג הרדמה נאותה כאשר אין נסיגת כפות בתגובה לצביטה בבוהן ואין רפלקס מצמוץ כאשר נוגעים בעדינות בקרנית. יש לתת הרדמה נוספת אם העכבר מראה סימני כאב, כגון היפר-ונטילציה או תנועת גפיים, בזמן הרדמה.

5. הרחבת הקשתית

1. יש להרחיב את קשתית העין כדי לחלחל עם טיפה אחת של 1% טרופיקמיד. יש להמתין 5 דקות להרחבה. מרחו על העין משחה עיניים כגון בציטראצין שלא תעבור חלחל.

6. צינורית תא קדמי

1. הנח היטב את העכבר המורדם במיטת הספוג מתחת למיקרוסקופ. יש למרוח תמיסת מלח על העיניים כדי לשטוף פסולת או פרווה מפני השטח של העיניים.
2. השתמשו בזוג מלקחיים ללא שיניים והציעו בעדינות את אחת העיניים.
   הערה: ניסוי ישתמש בעין שמאל או ימין של העכבר, אך לעולם לא בשתיהן על אותו עכבר.
3. כשקו העירוי סגור, יש לזרוק את החדר הקדמי עם המחט כ -2 מ"מ מהלימבוס. ודא שהמחט חודרת את הקרנית בניצב למשטח הקרנית ההיקפי והמעוקל, ואז שטוחה מעט במקביל למישור הקשתית. ניתן לתמרן את הקרנית כדי לקדם את המחט ולשמור על שליטה בעיניים. הימנע מפגיעה בקשתית או בעדשה והגדלת פצע הקרנית, מה שעלול לגרום לדליפה. הפרטים מתוארים בהרחבה על ידי Buchi et ^al.2.

7. שלב איסכמי

1. סובב את תא העצירה כדי להפעיל את קו העירוי. ודא שאין דליפה דרך פצע הקרנית. ודא שיש נפיחות הדרגתית של הקרנית ככל שהלחץ התוך עיני עולה.
   הערה: אם דליפה משמעותית לא נאטמת כשהקרנית מתרחבת, לא יישמר לחץ מתאים, וההליך יצטרך להיות על עכבר אחר.
2. בדוק שהלחץ התוך עיני עלה ל-90-100 מ"מ כספית עם טונומטר. אבטח את קו העירוי עם סרט, וודא בזהירות שהמחט לא תשנה את מיקומה ותתחיל לדלוף.
3. מרחו משחה עיניים כגון בציטראצין על העין המנופחת כדי למנוע יובש. הנח את העכבר הרחק מהמיקרוסקופ ומתחת לחימום lamp כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה ולפקח במשך 60 הדקות הבאות.
4. מדוד מחדש את הלחץ התוך עיני 30 דקות לפני סיום ההליך כדי לוודא שהלחץ התוך עיני הוא בין 90-100 מ"מ כספית.

8. שלב הרפרפוזיה

1. לאחר 60 דקות, החזר את העכבר למיקרוסקופ. הורידו את בקבוק תמיסת המלח לגובה העכבר, ונרמלו את הלחץ התוך עיני.
2. מדוד את הלחץ התוך עיני עם הטונומטריה כדי לבדוק שהוא קרוב לנורמה, 20 מ"מ כספית. לאחר שהלחץ התוך עיני מנורמל, הסר בזהירות את המחט, הימנע מנזק לעדשה או לקשתית.

9. טיפול לאחר הניתוח

1. מצפים את עיני העכבר בכל משחה אנטיבקטריאלית עיניים כגון משחת עיניים וטרינרית בציטראצין.
2. עקוב אחר העכבר במשך 1-2 שעות על משטח מחומם עד שהוא מתאושש לחלוטין מההרדמה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה. החזר את העכברים לכלובים ולדיור לאחר התאוששות מלאה.

10. הוצאת העין³

1. יש להרדים את העכבר תחילה עם תערובת של קטמין 100 מ"ג/ק"ג וקסילזין 10 מ"ג/ק"ג המוזרק תוך צפקית ולאחר מכן המתת חסד באמצעות פריקת צוואר הרחם.
2. מקם את העכבר שעבר המתת חסד על משטח שטוח, יבש וחלק. שטפו את העין בכמה טיפות תמיסת מלח.
3. הפעל לחץ עדין על הקנתוס הצדדי בעזרת המלקחיים עד שגלגל העין נעקר מהשקע ועצב הראייה נגיש. בעזרת מספריים של ווסטקוט, חתכו בעקבות שולי המסלול כדי לחתוך את השרירים החוץ-עיניים.
4. מקם את המספריים של Westcott בהיבט האחורי ביותר של ארובת העין וחתוך את עצב הראייה.

11. תיקון המדגם⁴

1. הנח את העין הגרעינית לתוך 4% פרפורמלדהיד ב-0.1 M PBS בבקבוקון אטום. לאחר 3 ימים, הסר את העין, הניח אותה בבקבוקון של תמיסת אתנול 70% ואחסן אותה למשך הלילה.
2. הסר את העיניים והניח אותן בבקבוקון של תמיסת אתנול 95%. לאחר מכן, הניחו את הבקבוקון בוואקום אטום למשך 15 דקות, הוציאו אותו מהוואקום והשאירו אותו באוויר החדר למשך 45 דקות.
3. חזור על תהליך הוואקום, והנח את העין ברצף בתמיסות הבאות: 100% אתנול, 100% אתנול, 100% תמיסת קסילן ו-100% תמיסת קסילן.
4. יש להסיר את העין ולהניח אותה בבקבוקון נקי וריק. מלאו את הבקבוקון בפרפין נוזלי של 60 מעלות צלזיוס. מכניסים את הבקבוקון לתנור ואקום אטום של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן 30 דקות בתנור 60 מעלות צלזיוס ללא ואקום.
5. מסירים את העין, מניחים אותה בבקבוקון נקי וריק וממלאים אותה בפרפין נוזלי בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. אחסן את הבקבוקון בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

12. הטמעת המדגם

1. מעבירים את העין לתבנית הטבעה ממתכת וממלאים את התבנית בפרפין נוזלי על פלטה חמה של 60 מעלות צלזיוס, מכוונים את העין לכיוון הרצוי כדי ליצור קטעים דרך הדיסק האופטי. הניחו לתבנית להתקרר בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן אחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

13. חיתוך המדגם⁵

1. העבר את הדגימות המשובצות למיקרוטום. חתוך לאט את הבלוק עד שמגיעים לעין והחלקים כוללים את הדיסק האופטי.
2. חותכים קטעים כסרטים בעובי 5 מיקרומטר ומציפים אותם על אמבט מים. הרם את סרט הפרפין בזהירות בעזרת מלקחיים, הניח סרטים של שלושה חלקים על שקופית ותן לו להתייבש למשך הלילה.
3. חזור על תהליך זה עד שיהיו לפחות 8 שקופיות לכל עין עם מקטעים שבמרכזם הדיסק האופטי.

14. הכתמת הסעיפים⁵

1. מחממים את השקופיות בתנור של 60 מעלות למשך שעה כדי להמיס את הפרפין. טבלו את השקופיות ב-RT קסילן שלוש פעמים, למשך 5 דקות כל אחת.
2. טבלו את השקופיות ב-100% אתנול שלוש פעמים, למשך 3 דקות כל אחת. שוטפים את החלקים במי ברז למשך דקה.
3. דגרו את החלקים בכתם המטוקסילין למשך 45 שניות. שוטפים את החלקים במי ברז למשך 2 דקות.
4. דגרו את החלקים במגיב הכחול למשך דקה אחת. שוטפים את החלקים במי ברז למשך דקה.
5. דגרו את החלקים באאוזין למשך 15 שניות.
6. שוטפים את החלקים באתנול 95% ו -100% פעמיים למשך דקה כל אחד. שוטפים את החלקים ב-100% קסילן ארבע פעמים, למשך דקה אחת כל אחת. לאחר מכן, הרכיב את השקופיות עם מדיית הרכבה.

15. ניתוח היסטולוגי⁶

1. נתח כל קטע רשתית תחת המיקרוסקופ ורשום את מספר קפלי הרשתית, אחוז אובדן התאים בשכבות הרשתית השונות (שכבת תאי הגנגליון, השכבה הגרעינית הפנימית, השכבה הגרעינית החיצונית), נוכחות של דימום בזגוגית או תת-רשתית, ומידת הנזק לאפיתל פיגמנט הרשתית. עיין בטבלה 1 לפרטים על קריטריוני הניקוד.

תוצאות

כדי להעריך את הפתולוגיה של הרשתית לאחר האיסכמיה/רפרפוזיה, נאספו עיניים מקבוצה אחת של עכברים יומיים לאחר ההליך ומקבוצה אחרת של עכברים 7 ימים לאחר ההליך. העיניים הגרעיניות נקבעו ב-4% פרפורמלדהיד, משובצות בפרפין, ונחתכו למקטעים של 5 מיקרומטר. החתכים נצבעו בהמטוקסילין ואאוזי?...

Discussion

מודל האיסכמיה/רפרפוזיה מספק שיטה הניתנת לשחזור לחקר המנגנונים והפתולוגיה של איסכמיה ברשתית/פגיעה ברפרפוזיה. למודל זה יש תועלת בחקר הפתולוגיה של איסכמיה ברשתית/פגיעה ברפרפוזיה, ולזיהוי מטרות טיפוליות. מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול עשויים להציב אתגרים ולדרוש מיומנויות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401