Induction d’une lésion d’ischémie-reperfusion rétinienne dans un modèle d’œil de souris

Résumé

Ce protocole modélise une lésion d’ischémie-reperfusion rétinienne dans un œil de souris en induisant une ischémie rétinienne par canulation de la chambre antérieure et élévation de la pression intraoculaire, suivie d’une normalisation de la pression intraoculaire pour initier la reperfusion.

Résumé

Les lésions ischémiques-reperfusionnelles sont connues pour provoquer une gamme de pathologies rétiniennes, notamment la rétinopathie diabétique, le glaucome, les occlusions vasculaires rétiniennes et d’autres affections vaso-occlusives. Ce manuscrit présente une méthode pour induire des lésions d’ischémie-reperfusion dans un modèle murin. La méthode utilisait une canulation de chambre antérieure attachée à un réservoir salin, générant une pression hydrostatique pour augmenter la pression intraoculaire à 90-100 mmHg. Cette méthode a effectivement provoqué la constriction des capillaires rétiniens pour induire une ischémie rétinienne. À la fin de la période ischémique (60 min), la pression intraoculaire a été normalisée (≤20 mmHg) avant de retirer la canule de la chambre antérieure pour initier la reperfusion. Quelques jours après la procédure d’ischémie/reperfusion, les yeux ont été prélevés et sectionnés pour une coloration histologique. L’histopathologie des coupes rétiniennes a été notée en évaluant huit paramètres de lésion rétinienne : plis, hémorragie, déformation, perte cellulaire dans la cellule ganglionnaire, les couches nucléaires internes, nucléaires externes et photoréceptrices, et les dommages aux cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes. Cette méthode a fourni un modèle reproductible pour étudier les mécanismes et la pathologie des lésions d’ischémie/reperfusion rétiniennes. De plus, ce modèle peut faciliter la découverte de cibles thérapeutiques potentielles pour traiter les lésions d’ischémie/reperfusion rétiniennes, faisant progresser l’étude des pathologies rétiniennes et améliorant les résultats pour les patients.

Introduction

Les lésions ischémiques/reperfusionnelles se manifestent par diverses pathologies rétiniennes, notamment la rétinopathie diabétique, le glaucome, les occlusions vasculaires rétiniennes et les affections vaso-occlusives associées. Compte tenu de la forte demande en oxygène de la rétine, elle est particulièrement sensible aux lésions d’ischémie/reperfusion, un phénomène impliqué dans la pathogenèse de maladies comme la rétinopathie diabétique. Cette forme de lésion entraîne la disparition des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), la dégénérescence morphologique de la rétine, la fonction rétinienne compromise et éventuellement une déficience visuelle¹. La modélisation de l’ischémie/reperfusion est appropriée pour les études sur les mécanismes et les réponses au traitement dans diverses pathologies rétiniennes liées aux lésions d’ischémie/reperfusion.

Nous nous sommes concentrés sur l’affinement d’un modèle de lésion d’ischémie/reperfusion dans l’œil de souris. Le modèle de canulation de la chambre antérieure pour les lésions d’ischémie rétinienne induites par la pression a été publié pour la première fois par Büchi et al. en 1991². Ils ont réussi à augmenter la pression intraoculaire à 110 mmHg pendant une période contrôlée. Ils ont constaté que la lésion rétinienne qui en a résulté était compatible avec des résultats similaires à l’occlusion vasculaire rétinienne et choroïdienne. En raison de sa méthodologie relativement simple et de son exécution rentable, il est devenu un modèle fonctionnel pour l’étude des lésions ischémiques rétiniennes. Nous avons ajouté l’étape supplémentaire consistant à abaisser la source d’infusion au niveau de la souris avant de retirer l’aiguille. Cela a empêché la formation d’une éventuelle différence de pression élevée dans l’œil lorsque l’aiguille a été retirée, provoquant des lésions intraoculaires non liées à l’ischémie/reperfusion.

L’objectif était de créer un modèle contrôlé et reproductible pour la recherche sur les mécanismes et la pathologie de l’ischémie/reperfusion rétinienne dans un modèle murin tout en minimisant les dommages procéduraux à l’œil. Ce modèle offre un moyen d’identifier des traitements potentiels et d’améliorer notre compréhension des pathologies rétiniennes associées à l’occlusion vasculaire.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément à un protocole d’utilisation des animaux approuvé par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Boston, conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Animaux d’expérimentation

1. Maisons C57BL/6J souris dans des conditions standard.

2. Préparation de la solution requise et de la ligne de perfusion

1. Dans une seringue de 50 ml, remplir d’une solution saline de NaCl stérilisée à 0,9 % à raison d’une par souris. Placez la seringue à une hauteur de 120 cm au-dessus du niveau de la surface de la paillasse.
2. Connectez la seringue remplie à une conduite de perfusion et à un robinet d’arrêt avec une aiguille de 30 G attachée à l’extrémité de la ligne. Rincez toutes les bulles d’air de la conduite.

3. Préparation de l’espace de travail

1. Installez un microscope chirurgical/de dissection sous la bouteille de solution saline.
2. Créez un lit pour stabiliser la souris pendant la procédure en découpant une dépression d’environ 6 cm x 3 cm dans une éponge et en la plaçant solidement dans un puits en polystyrène ou un autre récipient plat.

4. Anesthésie de la souris

1. Anesthésie la souris avec un mélange standard de kétamine et de xylazine à un niveau permettant d’obtenir une anesthésie profonde.
   REMARQUE : Dans ce protocole, un mélange de kétamine 100 mg/kg et de xylazine 10 mg/kg a été injecté par voie intrapéritonéale pour obtenir une profondeur d’anesthésie adéquate.
2. Obtenez une anesthésie adéquate lorsqu’il n’y a pas de retrait de la patte en réponse à un pincement de l’orteil et aucun réflexe de clignement lorsque la cornée est doucement touchée. Administrez une anesthésie supplémentaire si la souris présente des signes de douleur, tels qu’une hyperventilation ou un mouvement des membres, pendant l’anesthésie.

5. Dilatation de l’iris

1. Dilater l’iris de l’œil pour qu’il soit perfusé avec 1 goutte de tropicamide à 1 %. Prévoyez 5 min pour la dilatation. Appliquez une pommade ophtalmique telle que la bacitracine sur l’œil qui ne sera pas perfusé.

6. Canulation de la chambre antérieure

1. Placez solidement la souris anesthésiée dans le lit d’éponge sous le microscope. Appliquez une solution saline sur les yeux pour rincer les débris ou la fourrure de la surface de l’œil.
2. À l’aide d’une paire de pinces non dentées, proposez doucement l’un des yeux.
   REMARQUE : Une expérience utilisera l’œil gauche ou l’œil droit de la souris, mais jamais les deux sur la même souris.
3. Avec la ligne de perfusion fermée, canulez la chambre antérieure avec l’aiguille à environ 2 mm du limbe. Assurez-vous que l’aiguille perce la cornée perpendiculairement à la surface périphérique incurvée de la cornée, puis légèrement aplatie parallèlement au plan de l’iris. La cornée peut être manipulée pour faire avancer l’aiguille et maintenir le contrôle oculaire. Évitez de frapper l’iris ou le cristallin et d’élargir la plaie cornéenne, ce qui peut entraîner des fuites. Les détails sont décrits plus en détail par Buchi et ^al.2.

7. Phase ischémique

1. Tournez le robinet d’arrêt pour faire fonctionner la conduite d’infusion. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite à travers la plaie cornéenne. Assurez-vous qu’il y a une distension progressive de la cornée à mesure que la pression intraoculaire augmente.
   REMARQUE : Si une fuite importante ne scelle pas lorsque la cornée se distend, une pression adéquate ne sera pas maintenue et la procédure devra être effectuée sur une souris différente.
2. Vérifiez que la pression intraoculaire a atteint 90-100 mmHg à l’aide d’un tonomètre. Fixez la ligne de perfusion avec du ruban adhésif, en veillant soigneusement à ce que l’aiguille ne change pas de position et ne commence pas à fuir.
3. Appliquez une pommade ophtalmique telle que la bacitracine sur l’œil perfusé pour prévenir la sécheresse. Placez la souris loin du microscope et sous une lampe chauffante pour maintenir une température corporelle normale et surveillez pendant les 60 prochaines minutes.
4. Mesurez à nouveau la pression intraoculaire 30 minutes avant la fin de l’intervention pour vous assurer que la pression intraoculaire se situe entre 90 et 100 mmHg.

8. Phase de reperfusion

1. Après 60 min, remettez la souris dans le microscope. Abaissez le flacon de solution saline au niveau de la souris, en normalisant la pression intraoculaire.
2. Mesurez la pression intraoculaire à l’aide de la tonométrie pour vérifier qu’elle est proche de la normale, soit 20 mmHg. Une fois que la pression intraoculaire est normalisée, retirez soigneusement l’aiguille, en évitant d’endommager le cristallin ou l’iris.

9. Soins postopératoires

1. Enduire les yeux de souris avec une pommade antibactérienne ophtalmique telle qu’une pommade ophtalmique vétérinaire à la bacitracine.
2. Surveillez la souris pendant 1 à 2 h sur une surface chauffée jusqu’à ce qu’elle se remette complètement de l’anesthésie. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Remettez les souris dans les cages et les logements une fois qu’elles sont complètement rétablies.

10. Imprégner l’œil³

1. Anesthésier la souris avec un mélange de kétamine 100 mg/kg et de xylazine 10 mg/kg injecté par voie intrapéritonéale, puis euthanasier par luxation cervicale.
2. Placez la souris euthanasiée sur une surface plane, sèche et lisse. Rincez l’œil avec quelques gouttes de solution saline.
3. Appliquez une légère pression sur le canthus latéral avec la pince jusqu’à ce que le globe oculaire soit déplacé de l’orbite et que le nerf optique soit accessible. À l’aide de ciseaux Westcott, coupez en suivant les marges orbitales pour sectionner les muscles extraoculaires.
4. Positionnez les ciseaux Westcott sur la face la plus postérieure de l’orbite et sectionnez le nerf optique.

11. Fixation de l’échantillon⁴

1. Placez l’œil énucléé dans du paraformaldéhyde à 4 % dans 0,1 M de PBS dans un flacon scellé. Après 3 jours, retirez l’œil, placez-le dans un flacon de solution d’éthanol à 70 % et conservez-le toute la nuit.
2. Retirez les yeux et placez-les dans un flacon de solution d’éthanol à 95 %. Ensuite, placez le flacon dans un vide scellé pendant 15 min, retirez-le de l’aspirateur et laissez-le à l’air libre pendant 45 min.
3. Répétez le processus de vide, en plaçant séquentiellement l’œil dans les solutions suivantes : 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 100 % de solution de xylène et 100 % de solution de xylène.
4. Retirez l’œil et placez-le dans un flacon propre et vide. Remplissez le flacon de paraffine liquide à 60 °C. Placez le flacon dans un four sous vide à 60 °C scellé pendant 30 min, puis 30 min dans le four à 60 °C sans vide.
5. Retirez l’œil, placez-le dans un flacon propre et vide et remplissez-le de paraffine liquide à 60 °C. Conservez le flacon à 60 °C pendant la nuit.

12. Intégration de l’échantillon

1. Transférez l’œil dans un moule d’enrobage métallique et remplissez le moule de paraffine liquide sur une plaque chauffante à 60 °C, en orientant l’œil dans la direction souhaitée pour faire des sections à travers le disque optique. Laissez refroidir le moule à température ambiante (RT), puis conservez-le à 4 °C.

13. Section de l’échantillon⁵

1. Transférez les échantillons encastrés dans le microtome. Coupez lentement le bloc jusqu’à ce que l’œil soit atteint et que les sections incluent le disque optique.
2. Découpez des sections en rubans de 5 μm d’épaisseur et faites-les flotter sur un bain-marie. Soulevez soigneusement le ruban de paraffine à l’aide d’une pince, posez des rubans de trois sections sur une lame et laissez-le sécher pendant la nuit.
3. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’il y ait au moins 8 lames pour chaque œil avec des sections centrées sur le disque optique.

14. Coloration des sections⁵

1. Faites chauffer les lames dans un four à 60 °C pendant 1 h pour faire fondre la paraffine. Immergez les lames dans du xylène RT trois fois, pendant 5 minutes chacune.
2. Immergez les lames dans de l’éthanol à 100 % trois fois, pendant 3 minutes chacune. Rincez les sections à l’eau du robinet pendant 1 min.
3. Incuber les sections dans un colorant à l’hématoxyline pendant 45 s. Rincez les sections à l’eau du robinet pendant 2 min.
4. Incuber les sections dans le réactif de bleuissement pendant 1 min. Rincez les sections à l’eau du robinet pendant 1 min.
5. Incuber les sections dans eosin pendant 15 s.
6. Rincez les sections à 95 % et 100 % d’éthanol deux fois pendant 1 min chacune. Rincez les sections avec du xylène à 100 % quatre fois, pendant 1 minute chacune. Ensuite, montez les diapositives avec un support de montage.

15. Analyse histologique⁶

1. Analysez chaque coupe de la rétine au microscope et notez le nombre de plis rétiniens, le pourcentage de perte de cellules dans les différentes couches de la rétine (couche de cellules ganglionnaires, couche nucléaire interne, couche nucléaire externe), la présence d’une hémorragie vitréenne ou sous-rétinienne et l’étendue des lésions épithéliales pigmentaires rétiniennes. Voir le tableau 1 pour plus de détails sur les critères de notation.

Résultats

Pour évaluer la pathologie des rétines après l’ischémie/reperfusion, des yeux ont été prélevés sur un groupe de souris 2 jours après l’intervention et sur un autre groupe de souris 7 jours après l’intervention. Les yeux énucléés ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 %, incorporés dans de la paraffine et coupés en sections de 5 μm. Les coupes ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et imagées pour l’examen histologique (

Discussion

Le modèle d’ischémie/reperfusion fournit une méthode reproductible pour étudier les mécanismes et la pathologie des lésions d’ischémie/reperfusion rétiniennes. Ce modèle est utile pour étudier la pathologie de l’ischémie/lésion de reperfusion rétinienne et pour identifier des cibles thérapeutiques. Plusieurs étapes critiques du protocole peuvent poser des défis et nécessiter des compétences techniques pour être menées à bien. L’une d’entre elles est la canu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401