Indução de lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um modelo de olho de camundongo

Resumo

Este protocolo modela a lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um olho de camundongo, induzindo isquemia retiniana por meio de canulação da câmara anterior e elevação da pressão intraocular, seguida de normalização da pressão intraocular para iniciar a reperfusão.

Resumo

Sabe-se que as lesões de isquemia-reperfusão causam uma variedade de patologias retinianas, incluindo retinopatia diabética, glaucoma, oclusões vasculares da retina e outras condições vaso-oclusivas. Este manuscrito apresenta um método para induzir lesão de isquemia-reperfusão em um modelo de camundongo. O método utilizou canulação da câmara anterior acoplada a um reservatório de solução salina, gerando pressão hidrostática para elevar a pressão intraocular para 90-100 mmHg. Este método efetivamente causou constrição dos capilares retinianos para induzir isquemia retiniana. Ao final do período isquêmico (60 min), a pressão intraocular foi normalizada (≤20 mmHg) antes da retirada da cânula da câmara anterior para iniciar a reperfusão. Dias após o procedimento de isquemia/reperfusão, os olhos foram coletados e seccionados para coloração histológica. A histopatologia dos cortes retinianos foi pontuada avaliando oito parâmetros de lesão retiniana: dobras, hemorragia, deformação, perda celular na célula ganglionar, camadas nucleares internas, nucleares externas e fotorreceptoras e danos às células epiteliais pigmentares da retina. Este método forneceu um modelo reprodutível para estudar os mecanismos e a patologia da lesão de isquemia/reperfusão retiniana. Além disso, esse modelo pode facilitar a descoberta de potenciais alvos terapêuticos para tratar lesões de isquemia/reperfusão retiniana, avançando no estudo de patologias retinianas e melhorando os resultados dos pacientes.

Introdução

As lesões de isquemia/reperfusão se manifestam em várias patologias da retina, abrangendo retinopatia diabética, glaucoma, oclusões vasculares da retina e condições vaso-oclusivas relacionadas. Dada a alta demanda de oxigênio da retina, ela é particularmente suscetível à lesão de isquemia/reperfusão, fenômeno implicado na patogênese de doenças como a retinopatia diabética. Essa forma de lesão resulta na morte das células ganglionares da retina (RGCs), degeneração morfológica da retina, comprometimento da função retiniana e eventual comprometimento da visão¹. A modelagem da isquemia/reperfusão é apropriada para estudos sobre mecanismos e respostas ao tratamento em várias patologias retinianas relacionadas a lesões de isquemia/reperfusão.

Nós nos concentramos em refinar um modelo para lesão de isquemia/reperfusão no olho do camundongo. O modelo de canulação da câmara anterior para lesão de isquemia retiniana induzida por pressão foi publicado pela primeira vez por Büchi et al. em 1991². Eles aumentaram com sucesso a pressão intraocular para 110 mmHg por um tempo controlado. Eles descobriram que a lesão retiniana resultante era consistente com achados semelhantes à oclusão vascular retiniana e coroidal. Devido à sua metodologia relativamente simples e execução econômica, tornou-se um modelo funcional para o estudo da lesão isquêmica da retina. Adicionamos a etapa adicional de abaixar a fonte de infusão para o nível do camundongo antes de retirar a agulha. Isso evitou a formação de um possível diferencial de pressão elevado dentro do olho quando a agulha foi removida, causando dano intraocular não relacionado à isquemia/reperfusão.

O objetivo era criar um modelo controlado e replicável para pesquisar os mecanismos e a patologia da lesão de isquemia/reperfusão retiniana em um modelo de camundongo, minimizando os danos processuais ao olho. Este modelo oferece uma maneira de identificar possíveis tratamentos e melhorar nossa compreensão das patologias retinianas associadas à oclusão vascular.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com um protocolo de uso de animais aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Boston, de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e está em conformidade com a declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e visuais.

1. Animais experimentais

1. Camundongos C57BL/6J domésticos em condições padrão.

2. Preparando a solução necessária e a linha de infusão

1. Em uma seringa de 50 mL, encha com solução salina esterilizada de NaCl a 0,9% uma por camundongo. Coloque a seringa a uma altura de 120 cm acima do nível da superfície da bancada.
2. Ligue a seringa cheia a uma linha de perfusão e a uma torneira com uma agulha de 30 G fixada na extremidade da linha. Lave todas as bolhas de ar da linha.

3. Preparando o espaço de trabalho

1. Configure um microscópio cirúrgico/dissecante sob o frasco de solução salina.
2. Crie uma cama para estabilizar o mouse durante o procedimento, cortando uma depressão de aproximadamente 6 cm x 3 cm em uma esponja e colocando-a com segurança em um poço de isopor ou outro recipiente plano.

4. Anestesiando o mouse

1. Anestesie o camundongo com uma mistura padrão de cetamina e xilazina em um nível para obter uma anestesia profunda.
   NOTA: Neste protocolo, uma mistura de cetamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg foi injetada por via intraperitoneal para atingir a profundidade adequada da anestesia.
2. Obtenha anestesia adequada quando não houver retirada da pata em resposta a um beliscão do dedo do pé e nenhum reflexo de piscar quando a córnea for tocada suavemente. Administre anestesia adicional se o camundongo mostrar sinais de dor, como hiperventilação ou movimento dos membros, enquanto anestesiado.

5. Dilatando a íris

1. Dilate a íris do olho a ser perfundido com 1 gota de tropicamida a 1%. Aguarde 5 min para dilatação. Aplique uma pomada oftálmica, como bacitracina, no olho que não será perfundida.

6. Canulação da câmara anterior

1. Coloque com segurança o mouse anestesiado na cama de esponja sob o microscópio. Aplique solução salina nos olhos para enxaguar quaisquer detritos ou pelos da superfície ocular.
2. Use uma pinça não dentada e proponha suavemente um dos olhos.
   NOTA: Um experimento usará os olhos esquerdo ou direito do mouse, mas nunca os dois no mesmo mouse.
3. Com a linha de infusão fechada, canule a câmara anterior com a agulha a aproximadamente 2 mm do limbo. Certifique-se de que a agulha perfure a córnea perpendicularmente à superfície periférica e curva da córnea e, em seguida, ligeiramente achatada paralelamente ao plano da íris. A córnea pode ser manipulada para avançar a agulha e manter o controle ocular. Evite bater na íris ou no cristalino e aumentar a ferida da córnea, o que pode resultar em vazamento. Os detalhes são descritos por Buchi et ^al.2.

7. Fase isquêmica

1. Gire a torneira para executar a linha de infusão. Verifique se não há vazamento através da ferida da córnea. Certifique-se de que haja uma distensão gradual da córnea à medida que a pressão intraocular aumenta.
   NOTA: Se o vazamento significativo não selar à medida que a córnea se distende, a pressão adequada não será mantida e o procedimento terá que ser em um mouse diferente.
2. Verifique se a pressão intraocular aumentou para 90-100 mmHg com um tonômetro. Prenda a linha de infusão com fita adesiva, garantindo cuidadosamente que a agulha não mude de posição e comece a vazar.
3. Aplique uma pomada oftálmica, como bacitracina, no olho perfundido para evitar o ressecamento. Coloque o mouse longe do microscópio e embaixo de uma lâmpada de aquecimento para manter a temperatura corporal normal e monitore pelos próximos 60 minutos.
4. Meça novamente a pressão intraocular 30 minutos antes do término do procedimento para garantir que a pressão intraocular esteja entre 90-100 mmHg.

8. Fase de reperfusão

1. Após 60 min, retorne o mouse ao microscópio. Traga o frasco de solução salina até o nível do camundongo, normalizando a pressão intraocular.
2. Meça a pressão intraocular com a tonometria para verificar se está próxima do normal, 20 mmHg. Uma vez normalizada a pressão intraocular, remova cuidadosamente a agulha, evitando danos ao cristalino ou à íris.

9. Cuidados pós-operatórios

1. Cubra os olhos do rato com qualquer pomada antibacteriana oftálmica, como uma pomada oftálmica veterinária bacitracina.
2. Monitore o mouse por 1-2 h em uma superfície aquecida até que ele se recupere totalmente da anestesia. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Retorne os ratos às gaiolas e alojamentos depois de totalmente recuperados.

10. Enucleando o olho³

1. Anestesiar o camundongo primeiro com uma mistura de cetamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg injetada por via intraperitoneal e depois eutanasiar por luxação cervical.
2. Posicione o mouse sacrificado em uma superfície plana, seca e lisa. Enxágue o olho com algumas gotas de solução salina.
3. Aplique uma leve pressão no canto lateral com a pinça até que o globo ocular seja deslocado da cavidade e o nervo óptico esteja acessível. Usando uma tesoura Westcott, corte seguindo as margens orbitais para cortar os músculos extraoculares.
4. Posicione a tesoura de Westcott no aspecto mais posterior da órbita ocular e corte o nervo óptico.

11. Fixação da amostra⁴

1. Coloque o olho enucleado em paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M em um frasco selado. Após 3 dias, remova o olho, coloque-o em um frasco de solução de etanol a 70% e guarde-o durante a noite.
2. Remova os olhos e coloque-os em um frasco de solução de etanol a 95%. Em seguida, coloque o frasco em um vácuo selado por 15 min, remova-o do aspirador e deixe-o em ar ambiente por 45 min.
3. Repita o processo de vácuo, colocando sequencialmente o olho nas seguintes soluções: etanol 100%, etanol 100%, solução 100% xileno e solução 100% xileno.
4. Remova o olho e coloque-o em um frasco limpo e vazio. Encha o frasco com parafina liquidificada a 60 °C. Coloque o frasco para injetáveis em um forno a vácuo selado a 60 °C por 30 min e depois 30 min no forno a 60 °C sem vácuo.
5. Remova o olho, coloque-o em um frasco limpo e vazio e encha-o com parafina liquidificada a 60 ° C. Conservar o frasco para injetáveis a 60 °C durante a noite.

12. Incorporando a amostra

1. Transferir o olhal para um molde de embutir metálico e encher o molde com parafina liquidificada numa placa de aquecimento a 60 °C, orientando o olhal na direcção desejada para fazer secções através do disco óptico. Deixe o molde esfriar à temperatura ambiente (RT) e armazene a 4 °C.

13. Seccionamento da amostra⁵

1. Transfira as amostras incorporadas para o micrótomo. Apare lentamente o bloco até que o olho seja alcançado e as seções incluam o disco óptico.
2. Corte as seções como fitas de 5 μm de espessura e flutue-as em banho-maria. Levante a fita de parafina cuidadosamente usando uma pinça, coloque fitas de três seções em uma lâmina e deixe secar durante a noite.
3. Repita esse processo até que haja pelo menos 8 lâminas para cada olho com seções centralizadas no disco óptico.

14. Coloração das seções⁵

1. Aqueça as lâminas em um forno a 60 °C por 1 h para derreter a parafina. Mergulhe as lâminas em xileno RT três vezes, por 5 min cada.
2. Mergulhe as lâminas em etanol 100% três vezes, por 3 min cada. Enxágue as seções em água da torneira por 1 min.
3. Incube as seções na coloração de hematoxilina por 45 s. Enxágue as seções em água da torneira por 2 min.
4. Incube as seções no reagente azulado por 1 min. Enxágue as seções em água da torneira por 1 min.
5. Incube as seções em eosina por 15 s.
6. Enxágue as seções em etanol 95% e 100% duas vezes por 1 min cada. Enxágue as seções em xileno 100% quatro vezes, por 1 min cada. Em seguida, monte os slides com a mídia de montagem.

15. Análise histológica⁶

1. Analise cada seção da retina ao microscópio e registre o número de dobras retinianas, a porcentagem de perda de células nas várias camadas da retina (camada de células ganglionares, camada nuclear interna, camada nuclear externa), a presença de hemorragia vítrea ou sub-retiniana e a extensão do dano epitelial pigmentar da retina. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre os critérios de pontuação.

Resultados

Para avaliar a patologia das retinas após a isquemia/reperfusão, os olhos foram coletados de um grupo de camundongos 2 dias após o procedimento e de outro grupo de camundongos 7 dias após o procedimento. Os olhos enucleados foram fixados em paraformaldeído a 4%, incluídos em parafina e cortados em cortes de 5 μm. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (H&E) e visualizados para exame histológico (Figura 1). As imagens histológicas coradas ...

Discussão

O modelo de isquemia/reperfusão fornece um método reprodutível para estudar os mecanismos e a patologia da lesão de isquemia/reperfusão retiniana. Este modelo tem utilidade no estudo da patologia da lesão de isquemia/reperfusão retiniana e na identificação de alvos terapêuticos. Várias etapas críticas no protocolo podem representar desafios e exigir habilidades técnicas para serem concluídas com sucesso. Uma delas é a canulação propriamente dita, que pode levar várias t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401