Induzione di lesioni da ischemia-riperfusione retinica in un modello di occhio murino

Riepilogo

Questo protocollo modella il danno da ischemia-riperfusione retinica in un occhio di topo inducendo l'ischemia retinica tramite incannulamento della camera anteriore e aumento della pressione intraoculare, seguito dalla normalizzazione della pressione intraoculare per avviare la riperfusione.

Abstract

È noto che le lesioni da ischemia-riperfusione causano una serie di patologie retiniche, tra cui retinopatia diabetica, glaucoma, occlusioni vascolari retiniche e altre condizioni vaso-occlusive. Questo manoscritto presenta un metodo per indurre il danno da ischemia-riperfusione in un modello murino. Il metodo ha utilizzato l'incannulamento della camera anteriore collegato a un serbatoio salino, generando una pressione idrostatica per aumentare la pressione intraoculare a 90-100 mmHg. Questo metodo ha causato efficacemente la costrizione dei capillari retinici per indurre l'ischemia retinica. Al termine del periodo ischemico (60 min), la pressione intraoculare è stata normalizzata (≤20 mmHg) prima di rimuovere la cannula dalla camera anteriore per avviare la riperfusione. Giorni dopo la procedura di ischemia/riperfusione, gli occhi sono stati raccolti e sezionati per la colorazione istologica. L'istopatologia delle sezioni retiniche è stata valutata valutando otto parametri del danno retinico: pieghe, emorragia, deformazione, perdita di cellule nella cellula ganglionaria, strati nucleari interni, nucleari esterni e fotorecettori e danni alle cellule epiteliali pigmentate retiniche. Questo metodo ha fornito un modello riproducibile per studiare i meccanismi e la patologia del danno da ischemia/riperfusione retinica. Inoltre, questo modello può facilitare la scoperta di potenziali bersagli terapeutici per il trattamento del danno da ischemia/riperfusione retinica, facendo progredire lo studio delle patologie retiniche e migliorando gli esiti dei pazienti.

Introduzione

Le lesioni da ischemia/riperfusione si manifestano in varie patologie retiniche, tra cui retinopatia diabetica, glaucoma, occlusioni vascolari retiniche e condizioni vaso-occlusive correlate. Data l'elevata richiesta di ossigeno della retina, è particolarmente suscettibile al danno da ischemia/riperfusione, un fenomeno implicato nella patogenesi di malattie come la retinopatia diabetica. Questa forma di lesione provoca la morte delle cellule gangliari retiniche (RGC), la degenerazione morfologica della retina, la compromissione della funzione retinica e l'eventuale compromissione della vista¹. La modellazione dell'ischemia/riperfusione è appropriata per studi sui meccanismi e le risposte al trattamento in varie patologie retiniche correlate a lesioni da ischemia/riperfusione.

Ci siamo concentrati sul perfezionamento di un modello per il danno da ischemia/riperfusione nell'occhio del topo. Il modello di incannulamento della camera anteriore per il danno da ischemia retinica indotta da pressione è stato pubblicato per la prima volta da Büchi et al. nel 1991². Hanno aumentato con successo la pressione intraoculare a 110 mmHg per un tempo controllato. Hanno scoperto che la lesione retinica risultante era coerente con risultati simili all'occlusione vascolare retinica e coroideale. Grazie alla sua metodologia relativamente semplice e all'esecuzione economica, è diventato un modello funzionale per lo studio della lesione ischemica retinica. Abbiamo aggiunto il passaggio aggiuntivo di abbassare la fonte di infusione al livello del topo prima di estrarre l'ago. Ciò ha impedito la formazione di un possibile differenziale di pressione elevato all'interno dell'occhio quando l'ago è stato rimosso, causando danni intraoculari non correlati all'ischemia/riperfusione.

L'obiettivo era quello di creare un modello controllato e replicabile per la ricerca sui meccanismi e la patologia del danno da ischemia/riperfusione retinica in un modello murino, riducendo al minimo il danno procedurale all'occhio. Questo modello offre un modo per identificare potenziali trattamenti e migliorare la nostra comprensione delle patologie retiniche associate all'occlusione vascolare.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite secondo un protocollo di utilizzo degli animali approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Boston secondo la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono conformi alla dichiarazione dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Animali da esperimento

1. Ospita i topi C57BL/6J in condizioni standard.

2. Preparazione della soluzione e della linea di infusione necessarie

1. In una siringa da 50 mL, riempire con una soluzione salina sterilizzata di NaCl allo 0,9% una per topo. Posizionare la siringa a un'altezza di 120 cm sopra il livello della superficie del banco.
2. Collegare la siringa piena a una linea di infusione e a un rubinetto con un ago da 30 G attaccato all'estremità della linea. Eliminare tutte le bolle d'aria dalla linea.

3. Preparazione dell'area di lavoro

1. Installare un microscopio chirurgico/da dissezione sotto il flacone di soluzione fisiologica.
2. Crea un letto per stabilizzare il mouse durante la procedura ritagliando una depressione di circa 6 cm x 3 cm in una spugna e posizionandola saldamente in un pozzetto di polistirolo o in un altro contenitore piatto.

4. Anestetizzare il topo

1. Anestetizzare il topo con una miscela standard di ketamina e xilazina a un livello tale da ottenere un'anestesia profonda.
   NOTA: In questo protocollo, una miscela di ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg è stata iniettata per via intraperitoneale per ottenere un'adeguata profondità di anestesia.
2. Ottenere un'anestesia adeguata quando non c'è ritiro della zampa in risposta a un pizzicamento del dito del piede e nessun riflesso di ammiccamento quando la cornea viene toccata delicatamente. Somministrare ulteriore anestesia se il topo mostra segni di dolore, come iperventilazione o movimento degli arti, mentre è anestetizzato.

5. Dilatare l'iride

1. Dilatare l'iride dell'occhio da perfondere con 1 goccia di tropicamide all'1%. Lasciare 5 minuti per la dilatazione. Applicare un unguento oftalmico come la bacitracina sull'occhio che non verrà perfuso.

6. Incannulamento della camera anteriore

1. Posizionare saldamente il topo anestetizzato nel letto di spugna sotto il microscopio. Applicare una soluzione salina sugli occhi per sciacquare eventuali detriti o pelo dalla superficie dell'occhio.
2. Usa un paio di pinze non dentate e proponi delicatamente uno degli occhi.
   NOTA: un esperimento utilizzerà l'occhio sinistro o destro del mouse, ma mai entrambi sullo stesso mouse.
3. Con la linea di infusione chiusa, incannulare la camera anteriore con l'ago a circa 2 mm dal limbus. Assicurarsi che l'ago fori la cornea perpendicolarmente alla superficie periferica curva della cornea, quindi leggermente appiattita parallelamente al piano dell'iride. La cornea può essere manipolata per far avanzare l'ago e mantenere il controllo oculare. Evitare di colpire l'iride o il cristallino e di allargare la ferita corneale, che può causare perdite. I dettagli sono ulteriormente descritti da Buchi et ^al.2.

7. Fase ischemica

1. Ruotare il rubinetto per far funzionare la linea di infusione. Verificare che non vi siano perdite attraverso la ferita corneale. Assicurarsi che vi sia una graduale distensione della cornea all'aumentare della pressione intraoculare.
   NOTA: Se una perdita significativa non si sigilla mentre la cornea si distende, non verrà mantenuta una pressione adeguata e la procedura dovrà essere eseguita su un topo diverso.
2. Verificare che la pressione intraoculare sia salita a 90-100 mmHg con un tonometro. Fissare la linea di infusione con del nastro adesivo, assicurandosi che l'ago non cambi posizione e inizi a perdere.
3. Applicare un unguento oftalmico come la bacitracina sull'occhio perfuso per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse lontano dal microscopio e sotto una lampada riscaldante per mantenere la normale temperatura corporea e monitorare per i successivi 60 minuti.
4. Misurare nuovamente la pressione intraoculare a 30 minuti prima della fine della procedura per assicurarsi che la pressione intraoculare sia compresa tra 90 e 100 mmHg.

8. Fase di riperfusione

1. Dopo 60 minuti, rimettere il mouse al microscopio. Portare il flacone di soluzione salina fino al livello del topo, normalizzando la pressione intraoculare.
2. Misurare la pressione intraoculare con la tonometria per verificare che sia vicina alla norma, 20 mmHg. Una volta normalizzata la pressione intraoculare, rimuovere con cautela l'ago, evitando danni alla lente o all'iride.

9. Assistenza post-operatoria

1. Ricopri gli occhi del topo con qualsiasi unguento antibatterico oftalmico come un unguento oftalmico veterinario alla bacitracina.
2. Monitorare il mouse per 1-2 ore su una superficie riscaldata fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Rimetti i topi nelle gabbie e negli alloggi una volta che si sono completamente ripresi.

10. Enucleazione dell'occhio³

1. Anestetizzare prima il topo con una miscela di ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg iniettata per via intraperitoneale e poi sopprimere tramite lussazione cervicale.
2. Posiziona il mouse soppresso su una superficie piana, asciutta e liscia. Sciacquare l'occhio con qualche goccia di soluzione salina.
3. Applicare una leggera pressione sul canto laterale con la pinza fino a quando il bulbo oculare non viene spostato dall'alveolo e il nervo ottico è accessibile. Usando le forbici Westcott, tagliare seguendo i margini orbitali per recidere i muscoli extraoculari.
4. Posizionare le forbici di Westcott sulla parte più posteriore dell'orbita oculare e recidere il nervo ottico.

11. Fissaggio del campione⁴

1. Posizionare l'occhio enucleato in paraformaldeide al 4% in 0,1 M PBS in un flaconcino sigillato. Dopo 3 giorni, rimuovere l'occhio, metterlo in una fiala di soluzione di etanolo al 70% e conservarlo per una notte.
2. Togliere gli occhi e metterli in una fiala di soluzione di etanolo al 95%. Quindi, mettere la fiala in un sottovuoto sigillato per 15 minuti, rimuoverla dal vuoto e lasciarla all'aria ambiente per 45 minuti.
3. Ripetere il processo di vuoto, posizionando in sequenza l'occhio nelle seguenti soluzioni: etanolo al 100%, etanolo al 100%, soluzione di xilene al 100% e soluzione di xilene al 100%.
4. Rimuovere l'occhio e metterlo in un flaconcino pulito e vuoto. Riempire il flaconcino con paraffina liquida a 60 °C. Mettere la fiala in un forno sottovuoto sigillato a 60 °C per 30 minuti e poi 30 minuti nel forno a 60 °C senza vuoto.
5. Rimuovere l'occhio, metterlo in un flaconcino pulito e vuoto e riempirlo con paraffina liquida a 60 °C. Conservare il flaconcino a 60 °C per una notte.

12. Incorporamento del campione

1. Trasferire l'occhio in uno stampo da inclusione in metallo e riempire lo stampo con paraffina liquidizzata su una piastra riscaldante a 60 °C, orientando l'occhio nella direzione desiderata per creare sezioni attraverso il disco ottico. Lasciare raffreddare lo stampo a temperatura ambiente (RT), quindi conservare a 4 °C.

13. Sezionamento del campione⁵

1. Trasferire i campioni incorporati nel microtomo. Tagliare lentamente il blocco fino a raggiungere l'occhio e le sezioni includono il disco ottico.
2. Tagliare le sezioni come nastri di 5 μm di spessore e farle galleggiare a bagnomaria. Sollevare con cautela il nastro di paraffina con una pinza, adagiare i nastri di tre sezioni su un vetrino e lasciarlo asciugare per una notte.
3. Ripetere questo processo fino a quando non ci sono almeno 8 vetrini per ciascun occhio con sezioni centrate sul disco ottico.

14. Colorazione delle sezioni⁵

1. Scaldare i vetrini in forno a 60 °C per 1 ora per sciogliere la paraffina. Immergere i vetrini in xilene RT tre volte, per 5 minuti ciascuna.
2. Immergere i vetrini in etanolo al 100% tre volte, per 3 minuti ciascuna. Sciacquare le sezioni in acqua di rubinetto per 1 minuto.
3. Incubare le sezioni in colorazione di ematossilina per 45 s. Sciacquare le sezioni in acqua di rubinetto per 2 minuti.
4. Incubare le sezioni nel reagente Bluing per 1 minuto. Sciacquare le sezioni in acqua di rubinetto per 1 minuto.
5. Incubare le sezioni in eosina per 15 s.
6. Sciacquare le sezioni in etanolo al 95% e al 100% due volte per 1 minuto ciascuna. Sciacquare le sezioni in xilene al 100% quattro volte, per 1 minuto ciascuna. Quindi, montare le diapositive con i supporti di montaggio.

15. Analisi istologica⁶

1. Analizzare ogni sezione retinica al microscopio e registrare il numero di pieghe retiniche, la percentuale di perdita cellulare nei vari strati retinici (strato di cellule ganglionari, strato nucleare interno, strato nucleare esterno), la presenza di emorragia vitreale o sottoretinica e l'entità del danno epiteliale pigmentato retinico. Fare riferimento alla Tabella 1 per i dettagli sui criteri di punteggio.

Risultati

Per valutare la patologia della retina dopo l'ischemia/riperfusione, sono stati raccolti gli occhi da un gruppo di topi 2 giorni dopo la procedura e da un altro gruppo di topi 7 giorni dopo la procedura. Gli occhi enucleati sono stati fissati in paraformaldeide al 4%, incorporati in paraffina e tagliati in sezioni di 5 μm. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E) e sottoposte a imaging per l'esame istologico (Figura 1). Le immagini is...

Discussione

Il modello di ischemia/riperfusione fornisce un metodo riproducibile per studiare i meccanismi e la patologia del danno da ischemia/riperfusione retinica. Questo modello è utile per lo studio della patologia del danno da ischemia/riperfusione retinica e per l'identificazione di bersagli terapeutici. Diversi passaggi critici del protocollo possono rappresentare una sfida e richiedere competenze tecniche per essere completati con successo. Uno è l'incannulamento vero e proprio, che può ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401