Utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína O

Resumen

Aquí, presentamos el ensayo de cambio térmico, una técnica de alto rendimiento basada en fluorescencia que se utiliza para investigar la unión de moléculas pequeñas a proteínas de interés.

Resumen

Definir la importancia biológica de las proteínas con funciones desconocidas plantea un obstáculo importante en la comprensión de los procesos celulares. Aunque las predicciones bioinformáticas y estructurales han contribuido al estudio de proteínas desconocidas, las validaciones experimentales in vitro a menudo se ven obstaculizadas por las condiciones óptimas y los cofactores necesarios para la actividad bioquímica. La unión de cofactores no solo es esencial para la actividad de algunas enzimas, sino que también puede mejorar la estabilidad térmica de la proteína. Una aplicación práctica de este fenómeno radica en utilizar el cambio en la estabilidad térmica, medida por alteraciones en la temperatura de fusión de la proteína, para sondear la unión del ligando.

El ensayo de desplazamiento térmico (TSA) se puede utilizar para analizar la unión de diferentes ligandos a la proteína de interés o encontrar una condición estabilizadora para realizar experimentos como la cristalografía de rayos X. Aquí describiremos un protocolo para TSA que utiliza la pseudoquinasa, Selenoproteína O (SelO), para un método simple y de alto rendimiento para probar la unión de metales y nucleótidos. A diferencia de las quinasas canónicas, SelO se une a ATP en una orientación invertida para catalizar la transferencia de AMP a las cadenas laterales de hidroxilo de las proteínas en una modificación postraduccional conocida como ampilación de proteínas. Al aprovechar el cambio en las temperaturas de fusión, proporcionamos información crucial sobre las interacciones moleculares que subyacen a la función de SelO.

Introducción

Gran parte del proteoma humano sigue estando mal caracterizado. El "efecto farola" descrito por Dunham y Kustatscher et al. se refiere al fenómeno en el que las proteínas ampliamente investigadas reciben más atención, dejando de lado las proteínas poco estudiadas ^1,2. Los factores que contribuyen a este efecto incluyen la importancia biológica y la relevancia de la enfermedad de ciertas proteínas. Además, las investigaciones previas que ofrecen conocimientos fundamentales, así como la disponibilidad de herramientas para el análisis funcional, estimulan aún más la investigación....

Protocolo

1. Configuración experimental

1. Utilice un termociclador que pueda detectar fluorescencia, como un instrumento de RT-PCR, para realizar el protocolo descrito. Si utiliza SYPRO Orange, como se describe en este protocolo, utilice un modo de escaneo que permita la excitación en torno a los 470 nm y la detección de emisiones en torno a los 570 nm. Programe el termociclador para mantener la muestra a 20 °C durante 2 minutos, seguido de un aumento de la temperatura de 0,5 °C/1 min hasta 95 °C; medir la intensidad de fluorescencia cada 1 °C.
   NOTA: Recomendamos un paso opcional al final del ciclo para devolver el b....

Resultados

El SelO eucariota consta de una secuencia de diana mitocondrial N-terminal, un dominio similar a la quinasa y una selenocisteína altamente conservada en el extremo C de la proteína²³. Esta enzima residente en las mitocondrias codifica un dominio pseudoquinasa que se conserva de las bacterias a los seres humanos²³. El análisis estructural del homólogo SelO de Pseudomonas syringae reveló alteraciones de aminoácidos en el sitio .......

Discusión

El ensayo de desplazamiento térmico (TSA) sirve como un método eficiente para detectar las interacciones proteína-ligando, incluidas las que tienen cofactores e inhibidores. En este protocolo, utilizamos TSA para medir la unión de la pseudoquinasa SelO a nucleótidos y cationes divalentes. Nuestros hallazgos muestran que SelO exhibe una mayor estabilidad térmica en presencia de ATP y Mg²⁺/Mn²⁺. Esta observación se alinea con informes previos que indican que lo.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA