Utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína O

Resumen

Aquí, presentamos el ensayo de cambio térmico, una técnica de alto rendimiento basada en fluorescencia que se utiliza para investigar la unión de moléculas pequeñas a proteínas de interés.

Resumen

Definir la importancia biológica de las proteínas con funciones desconocidas plantea un obstáculo importante en la comprensión de los procesos celulares. Aunque las predicciones bioinformáticas y estructurales han contribuido al estudio de proteínas desconocidas, las validaciones experimentales in vitro a menudo se ven obstaculizadas por las condiciones óptimas y los cofactores necesarios para la actividad bioquímica. La unión de cofactores no solo es esencial para la actividad de algunas enzimas, sino que también puede mejorar la estabilidad térmica de la proteína. Una aplicación práctica de este fenómeno radica en utilizar el cambio en la estabilidad térmica, medida por alteraciones en la temperatura de fusión de la proteína, para sondear la unión del ligando.

El ensayo de desplazamiento térmico (TSA) se puede utilizar para analizar la unión de diferentes ligandos a la proteína de interés o encontrar una condición estabilizadora para realizar experimentos como la cristalografía de rayos X. Aquí describiremos un protocolo para TSA que utiliza la pseudoquinasa, Selenoproteína O (SelO), para un método simple y de alto rendimiento para probar la unión de metales y nucleótidos. A diferencia de las quinasas canónicas, SelO se une a ATP en una orientación invertida para catalizar la transferencia de AMP a las cadenas laterales de hidroxilo de las proteínas en una modificación postraduccional conocida como ampilación de proteínas. Al aprovechar el cambio en las temperaturas de fusión, proporcionamos información crucial sobre las interacciones moleculares que subyacen a la función de SelO.

Introducción

Gran parte del proteoma humano sigue estando mal caracterizado. El "efecto farola" descrito por Dunham y Kustatscher et al. se refiere al fenómeno en el que las proteínas ampliamente investigadas reciben más atención, dejando de lado las proteínas poco estudiadas ^1,2. Los factores que contribuyen a este efecto incluyen la importancia biológica y la relevancia de la enfermedad de ciertas proteínas. Además, las investigaciones previas que ofrecen conocimientos fundamentales, así como la disponibilidad de herramientas para el análisis funcional, estimulan aún más la investigación sobre proteínas altamente estudiadas ^1,2. Proyectos como la Iniciativa de Proteínas Poco Estudiadas, el Consorcio de Genómica Estructural y la Iniciativa de Función Enzimática tienen como objetivo caracterizar proteínas poco estudiadas utilizando proteómica estructural y funcional ^2,3,4. Un enfoque complementario para identificar las funciones moleculares de las proteínas poco estudiadas es examinar las interacciones de estas proteínas con moléculas pequeñas para obtener información valiosa sobre la regulación y la especificidad del sustrato.

La unión de moléculas pequeñas puede aumentar la estabilidad térmica de una proteína⁵. Este fenómeno, conocido como estabilización de la conformación inducida por el ligando, a menudo resulta en un aumento en la temperatura de fusión de una proteína, proporcionando una indicación medible de la unión del ligando⁶. La estabilidad térmica de una proteína se puede medir utilizando fluorimetría diferencial de barrido (DSF), también conocida como termofluor, o ensayo de desplazamiento térmico (TSA)7,8,9,10. En la TSA, una muestra de proteína se somete a temperaturas crecientes en presencia de un colorante sensible al medio ambiente⁶. A medida que la proteína se despliega y se desnaturaliza, el colorante se une a las regiones hidrofóbicas expuestas de la proteína y emite fluorescencia. Los colorantes fluorescentes extrínsecos, o tintes sensibles al medio ambiente, carecen de fluorescencia intrínseca y, en cambio, emiten fluorescencia al interactuar con su molécula objetivo ^9,11,12. El colorante más utilizado, SYPRO Orange, ofrece varias ventajas, como una mayor estabilidad y una fluorescencia de fondo mínima ^8,9,12. En particular, SYPRO Orange es compatible con los sistemas de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) debido a sus longitudes de onda de excitación y emisión de alrededor de 470 nm y 570 nm, respectivamente. Esta característica única permite mediciones de alto rendimiento, precisas y sensibles que son compatibles con los sistemas de detección de fluorescencia comúnmente utilizados en los sistemas RT-PCR⁸.

La TSA es una herramienta versátil para investigar las interacciones de las proteínas con posibles cofactores o fármacos y para identificar las condiciones estabilizadoras de la cristalografía. Algunas de sus ventajas sobre otros métodos de cribado son su relativa simplicidad de configuración y alto rendimiento con placas de 96 o 384 pocillos 13,14,15. El desarrollo de esta técnica ha sido transformador para los estudios de descubrimiento de fármacos, ya que ofrece comodidad y permite el estudio de diversos aditivos como iones, ligandos y fármacos ^6,16. Además, la adaptabilidad de la TSA ha animado a los científicos a ampliar su utilidad, facilitando la medición de las afinidades de unión junto con los ensayos de cribado^17,18. La TSA es una herramienta eficaz en los estudios de biología estructural para identificar las condiciones que promueven la estabilización de la proteína de interés para la cristalización¹⁹. Por lo tanto, su flexibilidad y relativa facilidad han posicionado a la TSA como una técnica fundamental en la caracterización de proteínas. Aquí, usaremos TSA para analizar la unión de metales y nucleótidos a la pseudoquinasa poco estudiada, la selenoproteína O (SelO), como ejemplo.

Las quinasas son una de las familias de proteínas más atacadas en el descubrimiento de^{fármacos 20}. Se predice que aproximadamente el 10% de las quinasas humanas son inactivas y se denominan pseudoquinasas porque carecen de los residuos catalíticos clave necesarios para la catálisis^21,22. La selenoproteína O (SelO) es una pseudoquinasa conservada evolutivamente que carece del aspartato conservado en el motivo catalítico HRD²³. En los eucariotas, SelO se localiza en las mitocondrias y protege a las células del estrés oxidativo^24,25. Los análisis estructurales y bioquímicos muestran que SelO transfiere monofosfato de adenosina (AMP) del ATP a sustratos proteicos en una modificación postraduccional conocida como AMPilation²⁵. Estudios recientes indican que las enzimas que catalizan la AMPilación pueden unirse a nucleótidos alternativos como UTP in vitro^26,27. En particular, los estudios han demostrado que el homólogo SelO de Salmonella typhimurium cataliza la proteína UMPilación, o la transferencia de UMP, de una manera dependiente del manganeso²⁸. Teniendo en cuenta estas intrigantes observaciones, probamos la unión de SelO a ATP y UTP en presencia de magnesio y manganeso, sirviendo como un ejemplo representativo de las aplicaciones de TSA. El siguiente protocolo se puede adaptar fácilmente para optimizar y examinar las interacciones de otras proteínas y aditivos de interés.

Protocolo

1. Configuración experimental

1. Utilice un termociclador que pueda detectar fluorescencia, como un instrumento de RT-PCR, para realizar el protocolo descrito. Si utiliza SYPRO Orange, como se describe en este protocolo, utilice un modo de escaneo que permita la excitación en torno a los 470 nm y la detección de emisiones en torno a los 570 nm. Programe el termociclador para mantener la muestra a 20 °C durante 2 minutos, seguido de un aumento de la temperatura de 0,5 °C/1 min hasta 95 °C; medir la intensidad de fluorescencia cada 1 °C.
   NOTA: Recomendamos un paso opcional al final del ciclo para devolver el bloque de muestra a 20 °C (Figura 1).
2. Cada reacción contiene cuatro componentes: tampón, proteína de interés, aditivo y colorante fluorescente extrínseco. Diseñe el experimento para incluir controles como sin proteína, sin colorante, proteína sin aditivos y solo aditivos para determinar cualquier fluorescencia de fondo que pueda influir en la interpretación de los resultados. Si está disponible, incluya un control positivo, como un aditivo conocido por unirse y estabilizar la proteína de interés.
3. Utilice proteína purificada para el ensayo. Para seguir este ejemplo, utilice E. coli SelO, expresada y purificada como se describió anteriormente^25,29. Brevemente, exprese SelO marcado con His-sumo (E. coli SelO ppSumo) en células Rosetta DE3 y purifíquelo utilizando la afinidad de Ni²⁺-NTA. Escinda la etiqueta His-sumo con proteasa Ulp y purifique aún más el SelO mediante cromatografía de filtración en gel.
4. La fluorescencia de SYPRO Orange dependerá de su interacción con la proteína de interés. Dado que estas interacciones variarán de una proteína a otra, optimice la concentración de proteínas y colorantes para obtener la máxima relación entre la señal y el ruido de la señal de fluorescencia.
   NOTA: SYPRO Orange no es compatible con algunas proteínas y aditivos como los detergentes^11,30. Los colorantes extrínsecos adicionales enumerados en el ^{punto 12} pueden examinarse según sea necesario.

2. Determinación de la concentración óptima de colorante (Figura 2A)

1. Prepare diluciones de 20 μL de 50x, 40x, 30x, 20x y 10x SYPRO Orange a partir de la solución madre, que se proporciona a 5.000x en DMSO.
2. Dispensar 8 μL de proteína de 6,25 μM diluida en tampón TSA en seis pocillos separados de una placa de PCR de 384 pocillos.
   NOTA: En nuestro ejemplo, utilizamos el siguiente tampón TSA para realizar las diluciones: 10 mM Tris pH 8, 150 mM de NaCl y 1 mM de DTT. Las muestras se pueden analizar por triplicado para mejorar la fiabilidad de los resultados.
3. Agregue 1 μL de tampón TSA a cada pocillo.
   NOTA: Este volumen de tampón se reemplazará con la adición de moléculas pequeñas después de la optimización de la concentración de colorantes y proteínas.
4. Añada 1 μL de cada dilución en serie de la solución de colorante SYPRO Orange a cada pocillo. Añada 1 μL de tampón sin colorante al pocillo final para el control sin colorante.
5. Cubra la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.
6. Gire brevemente la placa a 1.000 × g durante 1 min en una centrífuga equipada con un adaptador de placa PCR.
7. Coloque la placa en una máquina RT-PCR e inicie el protocolo de termociclado descrito en el paso 1.1.

3. Determinación de la concentración óptima de proteínas (Figura 2B)

1. Prepare 20 μL de diluciones en serie de 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM y 1,56 μM de proteína utilizando tampón TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM de NaCl y 1 mM de DTT).
2. Dispensar 8 μL de diluciones en serie de la proteína en cinco pocillos separados de una placa de 384 pocillos.
3. Dispense tampón solo en el^6º pozo como un control sin proteínas.
4. Agregue 1 μL de tampón TSA a cada pocillo.
   NOTA: Este volumen de tampón se reemplazará con la adición de moléculas pequeñas después de la optimización de la concentración de colorantes y proteínas.
5. Agregue 1 μL de cada solución de colorante SYPRO Orange 50x a cada pocillo.
6. Cubra la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.
7. Gire brevemente la placa a 1.000 × g durante 1 min en una centrífuga equipada con un adaptador de placa PCR.
8. Coloque la placa en una máquina RT-PCR e inicie el protocolo de termociclado descrito en el paso 1.1.

4. Configuración de un experimento de TSA (Figura 3A)

NOTA: Después de la optimización de las concentraciones de proteínas y colorantes de naranja SYPRO, el ensayo se puede realizar con la adición de las moléculas pequeñas deseadas para analizar la unión.

1. Definir el número de condiciones considerando las réplicas y los controles adecuados.
   NOTA: Por ejemplo, probaremos la unión de SelO a ocho condiciones por triplicado. Incluyendo los controles (sin aditivo, sin proteína y sin colorante), tenemos 11 reacciones x 3 (triplicado) = 33 reacciones en total.
2. En función de la concentración óptima de proteína y colorante observada para SelO, asegúrese de que cada reacción contenga 8 μL de 6,25 μM de proteína, 1 μL de aditivo y 1 μL de colorante SYPRO Orange 50x para un total de 10 μL de volumen de reacción. Por lo tanto, la concentración final utilizada es de 5 μM de proteína y 5x colorante SYPRO Orange.
3. Prepare 288 μL de solución de proteína de 6,25 μM utilizando tampón TSA. Este volumen de solución de trabajo de proteínas representa 36 reacciones (33 reacciones con un 10% adicional para variaciones en el pipeteo).
4. Dispense 8 μL de proteína de 6,25 μM en pocillos separados de una placa de 384 pocillos. Dispense tampón solo para el control sin proteínas.
5. Agregue 1 μL de moléculas pequeñas a una concentración de 10x para lograr 1x final. Para seguir este ejemplo, agregue 1 μL de 20 mM MgCl₂ para lograr una concentración final de 2 mM. Dispense tampón solo para el control sin aditivos.
6. Agregue 1 μL de cada solución de colorante SYPRO Orange 50x a cada pocillo.
7. Cubra la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.
8. Gire brevemente la placa a 1.000 × g durante 1 min en una centrífuga equipada con un adaptador de placa PCR.
9. Coloque la placa en una máquina RT-PCR e inicie el protocolo de termociclado descrito en el paso 1.1.

5. Análisis de datos

1. Exporte datos de la máquina RT-PCR para unidades de fluorescencia relativa (RFU) con respecto a la temperatura (°C).
2. Utilice el software de su elección para extraer y trazar puntos de datos hasta la intensidad más alta medida para cada curva de fusión. Es importante destacar que confirme que los controles sin proteínas y sin colorantes exhiben una fluorescencia de fondo baja sin aumentos de fluorescencia dependientes de la temperatura (Figura 3A, B y Tabla Suplementaria S1). Realice análisis de datos utilizando software de libre acceso como MoltenProt³¹ o DSFWorld³².
3. Determine la temperatura de fusión utilizando el ajuste sigmoidal de Boltzmann para los datos. La temperatura de fusión (T_m) se define como la temperatura a la que se observa un 50% de desnaturalización o la mitad de la intensidad máxima (Figura 3C).
4. Un cambio térmico en la curva de fusión puede sugerir aditivos estabilizadores o desestabilizadores. Para calcular el cambio de la temperatura de fusión (T_m), use la fórmula: T_m = T_m aditivo _- T_m tampón. Un valor positivo describe una condición estabilizadora o un aditivo que interactúa; un valor negativo describe una condición desestabilizadora (Figura 3D).

Resultados

El SelO eucariota consta de una secuencia de diana mitocondrial N-terminal, un dominio similar a la quinasa y una selenocisteína altamente conservada en el extremo C de la proteína²³. Esta enzima residente en las mitocondrias codifica un dominio pseudoquinasa que se conserva de las bacterias a los seres humanos²³. El análisis estructural del homólogo SelO de Pseudomonas syringae reveló alteraciones de aminoácidos en el sitio ...

Discusión

El ensayo de desplazamiento térmico (TSA) sirve como un método eficiente para detectar las interacciones proteína-ligando, incluidas las que tienen cofactores e inhibidores. En este protocolo, utilizamos TSA para medir la unión de la pseudoquinasa SelO a nucleótidos y cationes divalentes. Nuestros hallazgos muestran que SelO exhibe una mayor estabilidad térmica en presencia de ATP y Mg²⁺/Mn²⁺. Esta observación se alinea con informes previos que indican que lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA