Selenoprotein O에 대한 기질 결합을 프로브하기 위해 Thermal Shift Assay를 활용

요약

여기에서는 관심 단백질에 대한 소분자의 결합을 조사하는 데 사용되는 고처리량 형광 기반 기술인 열 이동 분석을 제시합니다.

초록

알려지지 않은 기능을 가진 단백질의 생물학적 중요성을 정의하는 것은 세포 과정을 이해하는 데 상당한 장애물이 됩니다. 생물정보학 및 구조적 예측이 미지의 단백질 연구에 기여했지만, 체외 실험 검증은 생화학적 활성에 필요한 최적의 조건과 보조 인자로 인해 종종 방해를 받습니다. 보조인자 결합은 일부 효소의 활성에 필수적일 뿐만 아니라 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수도 있습니다. 이 현상의 한 가지 실제 응용 분야는 단백질의 용융 온도 변화에 의해 측정된 열 안정성의 변화를 활용하여 리간드 결합을 조사하는 데 있습니다.

열 이동 분석(TSA)은 관심 단백질에 대한 다양한 리간드의 결합을 분석하거나 X선 결정학과 같은 실험을 수행하기 위한 안정화 조건을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 금속 및 뉴클레오티드 결합을 테스트하기 위한 간단하고 고처리량 방법을 위해 pseudokinase인 Selenoprotein O(SelO)를 사용하는 TSA용 프로토콜에 대해 설명합니다. 표준 키나아제와 달리 SelO는 ATP를 역방향으로 결합하여 단백질 AMPylation으로 알려진 번역 후 변형(posttranslational modification)에서 AMP가 단백질의 하이드록실 곁사슬로 전달되는 것을 촉매합니다. 용융 온도의 변화를 활용하여 SelO 기능의 기저에 있는 분자 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

서문

인간 단백질체의 대부분은 제대로 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. Dunham과 Kustatscher et al.에 의해 기술된 "가로등 효과"는 광대하게 연구된 단백질이 더 많은 주목을 받고, 충분히 연구되지 않은 단백질은 간과되는 현상을 말합니다 ^1,2. 이 효과에 기여하는 요인에는 특정 단백질의 생물학적 중요성 및 질병 관련성이 포함됩니다. 또한, 기능 분석을 위한 도구의 가용성뿐만 아니라 기초 지식을 제공하는 선행 연구는 고도로 연구된 단백질 ^1,2에 대한 연구를 더욱 자극합니다. Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium 및 Enzyme Function Initiative와 같은 프로젝트는 구조 및 기능 단백질체학을 사용하여 연구가 부족한 단백질을 특성화하는 것을 목표로^{합니다 2,3,4<....}

프로토콜

1. 실험 설정

1. RT-PCR 기기와 같이 형광을 감지할 수 있는 열 순환기를 사용하여 설명된 프로토콜을 수행합니다. 이 프로토콜에 설명된 대로 SYPRO Orange를 사용하는 경우 470nm 부근에서 여기, 570nm 부근에서 방출 감지를 허용하는 스캐닝 모드를 사용하십시오. 시료를 20°C에서 2분 동안 유지하도록 열순환기를 프로그래밍한 다음 0.5°C/1분 최대 95°C까지 온도를 높입니다. 1°C마다 형광 강도를 측정합니다.
   참고: 사이클이 끝날 때 샘플 블록을 20°C로 되돌리는 선택적 단계를 권장합니다(그림 1).
2. 각 반응에는 4가지 구성 요소, 즉 완충액, 관심 단백질, 첨가제 및 외부 형광 염료가 포함됩니다. 단백질 없음, 염료 없음, 첨가제가 없는 단백질, 첨가제만 사용과 같은 대조군을 포함하여 결과 해석에 영향을 줄 수 있는 배경 형광을 확인하도록 실험을 설계합니다. 가능한 경우, 관심 단백질과 결합하고 안정화하는 것으로 알려진 첨가제와 같은 양성 대조군을 포함합니다.
3. 분석을 위해 정제된 단백질을 사용하십시오. 이 예를 따르기 위해, 이전에 설명된 바와 같이 발현 및 정제된....

토론

TSA(Thermal Shift Assay)는 보조인자 및 억제제와의 상호작용을 포함하여 단백질-리간드 상호작용을 스크리닝하는 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜에서는 TSA를 사용하여 뉴클레오티드 및 2가 양이온에 대한 슈도키나아제 SelO의 결합을 측정했습니다. 우리의 연구 결과는 SelO가 ATP 및 Mg^{2 +} / Mn^{2 +}의 존재 하에서 증가 된 열 안정성을 나타낸다는 것을 보여줍니다........

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA