Selenoprotein O에 대한 기질 결합을 프로브하기 위해 Thermal Shift Assay를 활용

요약

여기에서는 관심 단백질에 대한 소분자의 결합을 조사하는 데 사용되는 고처리량 형광 기반 기술인 열 이동 분석을 제시합니다.

초록

알려지지 않은 기능을 가진 단백질의 생물학적 중요성을 정의하는 것은 세포 과정을 이해하는 데 상당한 장애물이 됩니다. 생물정보학 및 구조적 예측이 미지의 단백질 연구에 기여했지만, 체외 실험 검증은 생화학적 활성에 필요한 최적의 조건과 보조 인자로 인해 종종 방해를 받습니다. 보조인자 결합은 일부 효소의 활성에 필수적일 뿐만 아니라 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수도 있습니다. 이 현상의 한 가지 실제 응용 분야는 단백질의 용융 온도 변화에 의해 측정된 열 안정성의 변화를 활용하여 리간드 결합을 조사하는 데 있습니다.

열 이동 분석(TSA)은 관심 단백질에 대한 다양한 리간드의 결합을 분석하거나 X선 결정학과 같은 실험을 수행하기 위한 안정화 조건을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 금속 및 뉴클레오티드 결합을 테스트하기 위한 간단하고 고처리량 방법을 위해 pseudokinase인 Selenoprotein O(SelO)를 사용하는 TSA용 프로토콜에 대해 설명합니다. 표준 키나아제와 달리 SelO는 ATP를 역방향으로 결합하여 단백질 AMPylation으로 알려진 번역 후 변형(posttranslational modification)에서 AMP가 단백질의 하이드록실 곁사슬로 전달되는 것을 촉매합니다. 용융 온도의 변화를 활용하여 SelO 기능의 기저에 있는 분자 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

서문

인간 단백질체의 대부분은 제대로 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. Dunham과 Kustatscher et al.에 의해 기술된 "가로등 효과"는 광대하게 연구된 단백질이 더 많은 주목을 받고, 충분히 연구되지 않은 단백질은 간과되는 현상을 말합니다 ^1,2. 이 효과에 기여하는 요인에는 특정 단백질의 생물학적 중요성 및 질병 관련성이 포함됩니다. 또한, 기능 분석을 위한 도구의 가용성뿐만 아니라 기초 지식을 제공하는 선행 연구는 고도로 연구된 단백질 ^1,2에 대한 연구를 더욱 자극합니다. Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium 및 Enzyme Function Initiative와 같은 프로젝트는 구조 및 기능 단백질체학을 사용하여 연구가 부족한 단백질을 특성화하는 것을 목표로^{합니다 2,3,4}. 연구가 부족한 단백질의 분자 기능을 식별하기 위한 보완적인 접근법은 이러한 단백질과 작은 분자의 상호 작용을 조사하여 조절 및 기질 특이성에 대한 귀중한 통찰력을 얻는 것입니다.

작은 분자의 결합은 단백질의 열 안정성을 증가시킬 수 있다⁵. 리간드 유도 형태 안정화(ligand-induced conformation stabilization)로 알려진 이 현상은 종종 단백질의 용융 온도를 증가시켜 리간드 결합의 측정 가능한 지표를 제공합니다⁶. 단백질의 열적 안정성은 Thermofluor 또는 TSA(Thermal Shift Assay^)라고도 하는 DSF(Differential Scanning Fluorimetry)를 사용하여 측정할 수 있습니다7,8,9,10. TSA에서 단백질 샘플은 환경적으로 민감한 염료가 있는 상태에서 온도가 상승합니다⁶. 단백질이 풀리고 변성됨에 따라 염료는 단백질의 노출된 소수성 영역에 결합하고 형광을 방출합니다. 외부 형광 염료 또는 환경에 민감한 염료는 고유 형광이 부족하고 대신 표적 분자^9,11,12와 상호 작용할 때 형광을 발합니다. 가장 일반적으로 사용되는 염료인 SYPRO Orange는 향상된 안정성 및 최소 배경 형광 ^8,9,12와 같은 여러 가지 이점을 제공합니다. 특히 SYPRO Orange는 각각 약 470nm 및 570nm의 여기 및 방출 파장을 감안할 때 Real-Time Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) 시스템과 호환됩니다. 이 고유한 기능을 통해 RT-PCR 시스템⁸에서 일반적으로 사용되는 형광 검출 시스템과 호환되는 고처리량, 정확하고 감도 높은 측정이 가능합니다.

TSA는 단백질과 잠재적 보조 인자 또는 약물의 상호 작용을 조사하고 결정학을 위한 안정화 조건을 식별하기 위한 다목적 도구입니다. 다른 스크리닝 방법에 비해 장점 중 일부는 설정이 상대적으로 간단하고 96웰 또는 384웰 플레이트(13,14,15)를 사용한 높은 처리량입니다. 이 기술의 개발은 약물 발견 연구에 혁신을 일으켜 편의성을 제공하고 이온, 리간드 및 약물과 같은 다양한 첨가제의 연구를 가능하게 했습니다 ^6,16. 더욱이, TSA의 적응성은 과학자들이 그 유용성을 확장하도록 장려하여 스크리닝 분석(^17,18)과 함께 결합 친화도의 측정을 용이하게 했습니다. TSA는 결정화에 대한 관심 단백질의 안정화를 촉진하는 조건을 식별하기 위한 구조 생물학 연구에서 효과적인 도구입니다¹⁹. 따라서 TSA의 유연성과 상대적 용이성은 단백질을 특성화하는 데 있어 초석 기법으로 자리매김했습니다. 여기에서는 TSA를 사용하여 연구가 부족한 슈도키나아제인 Selenoprotein O(SelO)에 대한 금속 및 뉴클레오티드의 결합을 분석합니다.

키나아제(kinase)는 신약 개발²⁰에서 가장 표적이 되는 단백질군 중 하나입니다. 인간 키나아제의 약 10%는 비활성으로 예측되며 촉매 작용에 필요한 주요 촉매 잔기가 부족하기 때문에 슈도키나아제(pseudokinase)로 명명됩니다^21,22. 셀레노프로테인 O(SelO)는 촉매 HRD 모티프²³에서 보존된 아스파르테이트가 결핍된 진화적으로 보존된 슈도키나아제입니다. 진핵 생물에서 SelO는 미토콘드리아에 국한되어 산화 스트레스로부터 세포를 보호합니다^24,25. 구조 및 생화학적 분석에 따르면 SelO는 AMPylation²⁵로 알려진 번역 후 변형을 통해 ATP에서 단백질 기질로 아데노신 일인산(AMP)을 전달합니다. 최근 연구에 따르면 AMPylation을 촉매하는 효소는 in vitro^26,27과 같은 대체 뉴클레오티드와 결합할 수 있습니다. 특히, 연구에 따르면 Salmonella typhimurium의 SelO 상동체는 망간 의존성 방식으로 단백질 UMPylation 또는 UMP의 전달을 촉매합니다²⁸. 이러한 흥미로운 관찰을 감안할 때, 우리는 마그네슘과 망간의 존재 하에서 SelO와 ATP 및 UTP의 결합을 테스트하며, 이는 TSA 응용 분야의 대표적인 예입니다. 다음 프로토콜은 다른 단백질 및 관심 첨가제의 상호 작용을 최적화하고 검사하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 실험 설정

1. RT-PCR 기기와 같이 형광을 감지할 수 있는 열 순환기를 사용하여 설명된 프로토콜을 수행합니다. 이 프로토콜에 설명된 대로 SYPRO Orange를 사용하는 경우 470nm 부근에서 여기, 570nm 부근에서 방출 감지를 허용하는 스캐닝 모드를 사용하십시오. 시료를 20°C에서 2분 동안 유지하도록 열순환기를 프로그래밍한 다음 0.5°C/1분 최대 95°C까지 온도를 높입니다. 1°C마다 형광 강도를 측정합니다.
   참고: 사이클이 끝날 때 샘플 블록을 20°C로 되돌리는 선택적 단계를 권장합니다(그림 1).
2. 각 반응에는 4가지 구성 요소, 즉 완충액, 관심 단백질, 첨가제 및 외부 형광 염료가 포함됩니다. 단백질 없음, 염료 없음, 첨가제가 없는 단백질, 첨가제만 사용과 같은 대조군을 포함하여 결과 해석에 영향을 줄 수 있는 배경 형광을 확인하도록 실험을 설계합니다. 가능한 경우, 관심 단백질과 결합하고 안정화하는 것으로 알려진 첨가제와 같은 양성 대조군을 포함합니다.
3. 분석을 위해 정제된 단백질을 사용하십시오. 이 예를 따르기 위해, 이전에 설명된 바와 같이 발현 및 정제된 E. coli SelO를 사용한다^25,29. 간단히 말해서, Rosetta DE3 세포에서 His-sumo tagged SelO(E. coli SelO ppSumo)를 발현하고 Ni²⁺-NTA 친화성을 사용하여 정제합니다. Ulp 프로테아제를 사용하여 His-sumo 태그를 절단하고 겔 여과 크로마토그래피로 SelO를 추가로 정제합니다.
4. SYPRO Orange의 형광은 관심 단백질과의 상호 작용에 따라 달라집니다. 이러한 상호 작용은 단백질마다 다르므로 형광 신호의 최대 신호 대 잡음비를 얻기 위해 단백질 및 염료 농도를 최적화하십시오.
   알림: SYPRO Orange는 세제^11,30과 같은 일부 단백질 및 첨가제와 호환되지 않습니다. ¹²에 나열된 추가 외인성 염료는 필요에 따라 스크리닝할 수 있습니다.

2. 최적의 염료 농도 결정(그림 2A)

1. DMSO에서 5,000x로 제공되는 원액에서 50x, 40x, 30x, 20x 및 10x SYPRO Orange의 20μL 희석액을 준비합니다.
2. TSA 버퍼에 희석된 6.25μM 단백질 8μL를 384웰 PCR 플레이트의 6개 개별 웰에 분주합니다.
   참고: 이 예에서는 10mM Tris pH 8, 150mM NaCl 및 1mM DTT와 같은 TSA 버퍼를 사용하여 희석을 수행했습니다. 샘플은 결과의 신뢰성을 향상시키기 위해 세 번에 걸쳐 실행될 수 있습니다.
3. 각 웰에 1μL의 TSA 버퍼를 추가합니다.
   참고: 이 부피의 완충액은 염료 및 단백질 농도를 최적화한 후 소분자를 추가하는 것으로 대체됩니다.
4. 각 웰에 SYPRO Orange 염료 용액의 각 연속 희석액 1μL를 추가합니다. 무염료 제어를 위해 최종 웰에 염료 없는 완충액 1μL를 추가합니다.
5. 광학적으로 투명한 접착 필름으로 플레이트를 덮습니다.
6. PCR 플레이트 어댑터가 장착된 원심분리기에서 1,000× g 의 속도로 플레이트를 1분 동안 잠시 회전시킵니다.
7. 플레이트를 RT-PCR 기계에 놓고 1.1단계에서 설명한 열순환 프로토콜을 시작합니다.

3. 최적의 단백질 농도 측정(그림 2B)

1. TSA 완충액(25mM Tris pH 10, 150mM NaCl 및 1mM DTT)을 사용하여 25μM, 12.5μM, 6.25μM, 3.125μM 및 1.56μM의 연속 희석액 20μL를 준비합니다.
2. 8μL의 연속 희석된 단백질을 384웰 플레이트의 5개 개별 웰에 분주합니다.
3. 완충액은 6^번째 웰에만 분배하고 단백질 컨트롤이 없습니다.
4. 각 웰에 1μL의 TSA 버퍼를 추가합니다.
   참고: 이 부피의 완충액은 염료 및 단백질 농도를 최적화한 후 소분자를 추가하는 것으로 대체됩니다.
5. 각 50x SYPRO 오렌지 염료 용액 1μL를 각 웰에 추가합니다.
6. 광학적으로 투명한 접착 필름으로 플레이트를 덮습니다.
7. PCR 플레이트 어댑터가 장착된 원심분리기에서 1,000× g 의 속도로 플레이트를 1분 동안 잠시 회전시킵니다.
8. 플레이트를 RT-PCR 기계에 놓고 1.1단계에서 설명한 열순환 프로토콜을 시작합니다.

4. TSA 실험 설정(그림 3A)

참고: 단백질 및 SYPRO Orange 염료 농도를 최적화한 후 결합을 분석하기 위해 원하는 소분자를 추가하여 분석을 수행할 수 있습니다.

1. 반복실험과 적절한 제어를 고려하여 조건의 수를 정의합니다.
   참고: 예를 들어, SelO가 8가지 조건에 세 번 바인딩되는 것을 테스트합니다. 대조군(첨가물 없음, 단백질 없음, 염료 없음)을 포함하여 11개의 반응 x 3(삼중) = 총 33개의 반응이 있습니다.
2. SelO에 대해 관찰된 단백질 및 염료의 최적 농도를 기반으로 각 반응에 총 10μL 반응 부피에 대해 8μL의 6.25μM 단백질, 1μL의 첨가제 및 1μL의 50x SYPRO Orange 염료가 포함되어 있는지 확인합니다. 따라서 사용되는 최종 농도는 5μM 단백질과 5x SYPRO 오렌지 염료입니다.
3. TSA 완충액을 사용하여 288μL의 6.25μM 단백질 용액을 준비합니다. 이 부피의 단백질 작업 용액은 36개의 반응을 설명합니다(33개의 반응과 피펫팅의 변동에 대한 추가 10%)를 설명합니다.
4. 8μL의 6.25μM 단백질을 384웰 플레이트의 별도 웰에 분주합니다. 단백질 없이 투여할 수 있는 경우에만 완충액을 분주합니다.
5. 10x 농도에서 1μL의 소분자를 추가하여 최종 1x를 얻습니다. 이 예를 따르려면 1μL의 20mM MgCl₂ 를 추가하여 최종 농도 2mM를 얻습니다. 첨가제 없는 제어를 위해서만 버퍼를 분주하십시오.
6. 각 50x SYPRO 오렌지 염료 용액 1μL를 각 웰에 추가합니다.
7. 광학적으로 투명한 접착 필름으로 플레이트를 덮습니다.
8. PCR 플레이트 어댑터가 장착된 원심분리기에서 1,000× g 의 속도로 플레이트를 1분 동안 잠시 회전시킵니다.
9. 플레이트를 RT-PCR 기계에 놓고 1.1단계에서 설명한 열순환 프로토콜을 시작합니다.

5. 데이터 분석

1. 온도(°C)에 대한 상대 형광 단위(RFU)에 대한 RT-PCR 기계에서 데이터를 내보냅니다.
2. 선택한 소프트웨어를 사용하여 각 용융 곡선에 대해 측정된 최고 강도까지 데이터 포인트를 추출하고 플롯할 수 있습니다. 중요한 것은 단백질이 없고 염료가 없는 대조군이 온도에 따른 형광 증가 없이 낮은 배경 형광을 나타낸다는 것을 확인하는 것입니다(그림 3A, B 및 보충 표 S1). MoltenProt³¹ 또는 DSFWorld³²와 같이 무료로 액세스할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.
3. 데이터에 대해 Boltzmann Sigmoidal Fit을 사용하여 용융 온도를 결정합니다. 용융 온도(Tm_)는 50% 변성 또는 절반의 최대 강도가 관찰되는 온도로 정의됩니다(그림 3C).
4. 용융 곡선의 열 이동은 첨가제를 안정화 또는 불안정하게 만드는 것을 제안할 수 있습니다. 용융 온도(Tm)의 변화를 계산하려면 T_m = T_m 첨가제_- T_m 버퍼 공식을 사용하십시오. 양수 값은 안정화 조건 또는 상호 작용하는 첨가제를 설명합니다. 음수 값은 불안정한 상태를 나타냅니다(그림 3D).

결과

진핵생물 SelO는 N-말단 미토콘드리아 표적 서열, 키나아제와 유사한 도메인 및 단백질²³의 C-말단에서 고도로 보존된 셀레노시스테인으로 구성됩니다. 이 미토콘드리아 상주 효소는 박테리아에서 인간에게 보존되는 슈도키나아제 도메인을 암호화한다²³. 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae)의 SelO 상동체(homolog)에 대한 구조 분석?...

토론

TSA(Thermal Shift Assay)는 보조인자 및 억제제와의 상호작용을 포함하여 단백질-리간드 상호작용을 스크리닝하는 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜에서는 TSA를 사용하여 뉴클레오티드 및 2가 양이온에 대한 슈도키나아제 SelO의 결합을 측정했습니다. 우리의 연구 결과는 SelO가 ATP 및 Mg^{2 +} / Mn^{2 +}의 존재 하에서 증가 된 열 안정성을 나타낸다는 것을 보여줍니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA