Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Zusammenfassung

Hier stellen wir den Thermal Shift Assay vor, eine fluoreszenzbasierte Hochdurchsatztechnik, mit der die Bindung kleiner Moleküle an interessante Proteine untersucht wird.

Zusammenfassung

Die Definition der biologischen Bedeutung von Proteinen mit unbekannten Funktionen stellt ein erhebliches Hindernis für das Verständnis zellulärer Prozesse dar. Obwohl bioinformatische und strukturelle Vorhersagen zur Untersuchung unbekannter Proteine beigetragen haben, werden experimentelle In-vitro-Validierungen oft durch die optimalen Bedingungen und Cofaktoren erschwert, die für die biochemische Aktivität erforderlich sind. Die Cofaktorbindung ist nicht nur für die Aktivität einiger Enzyme unerlässlich, sondern kann auch die thermische Stabilität des Proteins verbessern. Eine praktische Anwendung dieses Phänomens besteht darin, die Änderung der thermischen Stabilität, die durch Änderungen der Schmelztemperatur des Proteins gemessen wird, zu nutzen, um die Ligandenbindung zu sondieren.

Der Thermoshift-Assay (TSA) kann verwendet werden, um die Bindung verschiedener Liganden an das interessierende Protein zu analysieren oder einen stabilisierenden Zustand für die Durchführung von Experimenten wie der Röntgenkristallographie zu finden. Hier werden wir ein Protokoll für TSA beschreiben, das die Pseudokinase Selenoprotein O (SelO) für eine einfache Hochdurchsatzmethode zum Testen der Metall- und Nukleotidbindung verwendet. Im Gegensatz zu kanonischen Kinasen bindet SelO ATP in umgekehrter Orientierung, um den Transfer von AMP auf die Hydroxylseitenketten von Proteinen in einer posttranslationalen Modifikation, der sogenannten Protein-AMPylierung, zu katalysieren. Indem wir die Verschiebung der Schmelztemperaturen nutzen, liefern wir entscheidende Einblicke in die molekularen Wechselwirkungen, die der SelO-Funktion zugrunde liegen.

Einleitung

Ein Großteil des menschlichen Proteoms ist nach wie vor schlecht charakterisiert. Der von Dunham und Kustatscher et al. beschriebene "Straßenlaterneneffekt" bezieht sich auf das Phänomen, bei dem umfangreich erforschten Proteinen mehr Aufmerksamkeit geschenkt wird und wenig untersuchte Proteine übersehen werden ^1,2. Zu diesem Effekt tragen unter anderem die biologische Bedeutung und die Krankheitsrelevanz bestimmter Proteine bei. Darüber hinaus stimulieren frühere Forschungen, die grundlegendes Wissen bieten, sowie die Verfügbarkeit von Werkzeugen für die Funktionsanalyse die Forschung an hoch untersuchten Proteinen^{weiter 1,2}. Projekte wie die Understudy Proteins Initiative, das Structural Genomics Consortium und die Enzyme Function Initiative zielen darauf ab, wenig untersuchte Proteine mit Hilfe der strukturellen und funktionellen Proteomik zu charakterisieren ^2,3,4. Ein komplementärer Ansatz zur Identifizierung der molekularen Funktionen von wenig untersuchten Proteinen besteht darin, die Wechselwirkungen dieser Proteine mit kleinen Molekülen zu untersuchen, um wertvolle Einblicke in die Regulation und Substratspezifität zu gewinnen.

Die Bindung kleiner Moleküle kann die thermische Stabilität eines Proteins erhöhen⁵. Dieses Phänomen, das als ligandeninduzierte Konformationsstabilisierung bezeichnet wird, führt häufig zu einem Anstieg der Schmelztemperatur eines Proteins, was einen messbaren Hinweis auf die Ligandenbindung liefert⁶. Die thermische Stabilität eines Proteins kann mit der Differential Scanning Fluorimetrie (DSF), auch bekannt als Thermofluor, oder dem Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10 gemessen werden. Bei der TSA wird eine Proteinprobe in Gegenwart eines umweltempfindlichen Farbstoffs⁶ steigenden Temperaturen ausgesetzt. Während sich das Protein entfaltet und denaturiert, bindet der Farbstoff an die freiliegenden hydrophoben Bereiche des Proteins und emittiert Fluoreszenz. Extrinsische Fluoreszenzfarbstoffe oder umweltempfindliche Farbstoffe haben keine intrinsische Fluoreszenz und fluoreszieren stattdessen bei Wechselwirkung mit ihrem Zielmolekül ^9,11,12. Der am häufigsten verwendete Farbstoff, SYPRO Orange, bietet mehrere Vorteile wie erhöhte Stabilität und minimale Hintergrundfluoreszenz ^8,9,12. Insbesondere ist SYPRO Orange aufgrund seiner Anregungs- und Emissionswellenlängen um 470 nm bzw. 570 nm mit Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionssystemen (RT-PCR) kompatibel. Diese einzigartige Funktion ermöglicht genaue, und empfindliche Messungen mit hohem Durchsatz, die mit Fluoreszenzdetektionssystemen kompatibel sind, die üblicherweise in RT-PCR-Systemen verwendet^{werden 8}.

TSA ist ein vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung von Proteininteraktionen mit potenziellen Cofaktoren oder Medikamenten und zur Identifizierung stabilisierender Bedingungen für die Kristallographie. Zu den Vorteilen gegenüber anderen Screening-Methoden gehören die relativ einfache Einrichtung und der hohe Durchsatz mit 96- oder 384-Well-Platten 13,14,15. Die Entwicklung dieser Technik war für Studien zur Wirkstoffforschung transformativ, da sie Komfort bietet und die Untersuchung verschiedener Zusatzstoffe wie Ionen, Liganden und Arzneimittel ermöglicht ^6,16. Darüber hinaus hat die Anpassungsfähigkeit von TSA die Wissenschaftler dazu ermutigt, seinen Nutzen zu erweitern und die Messung von Bindungsaffinitäten neben den Screening-Assays zu erleichtern^17,18. TSA ist ein wirksames Werkzeug in strukturbiologischen Studien, um Bedingungen zu identifizieren, die die Stabilisierung des für die Kristallisation interessierenden Proteins fördern¹⁹. Daher haben seine Flexibilität und relative Leichtigkeit TSA als Eckpfeiler bei der Charakterisierung von Proteinen positioniert. Hier werden wir TSA verwenden, um die Bindung von Metallen und Nukleotiden an die wenig untersuchte Pseudokinase Selenoprotein O (SelO) als Beispiel zu analysieren.

Kinasen sind eine der am häufigsten angegriffenen Proteinfamilien in der Wirkstoffforschung²⁰. Es wird prognostiziert, dass etwa 10 % der menschlichen Kinasen inaktiv sind und als Pseudokinasen bezeichnet werden, da ihnen wichtige katalytische Rückstände fehlen, die für die Katalyse erforderlich sind^21,22. Selenoprotein O (SelO) ist eine evolutionär konservierte Pseudokinase, der das konservierte Aspartat im katalytischen HRD-Motiv fehlt²³. In Eukaryoten ist SelO in den Mitochondrien lokalisiert und schützt die Zellen vor oxidativem Stress ^24,25. Strukturelle und biochemische Analysen zeigen, dass SelO Adenosinmonophosphat (AMP) von ATP auf Proteinsubstrate in einer posttranslationalen Modifikation überträgt, die als AMPylierung²⁵ bekannt ist. Neuere Studien deuten darauf hin, dass Enzyme, die die AMPylierung katalysieren, alternative Nukleotide wie UTP in vitro binden können ^26,27. Insbesondere haben Studien gezeigt, dass das SelO-Homolog aus Salmonella typhimurium die Protein-UMPylierung oder den Transfer von UMP auf manganabhängige Weise katalysiert²⁸. Angesichts dieser faszinierenden Beobachtungen testen wir die Bindung von SelO an ATP und UTP in Gegenwart von Magnesium und Mangan, was als repräsentatives Beispiel für die Anwendungen von TSA dient. Das folgende Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Wechselwirkungen anderer Proteine und Zusatzstoffe von Interesse zu optimieren und zu untersuchen.

Protokoll

1. Versuchsaufbau

1. Verwenden Sie einen Thermocycler, der Fluoreszenz nachweisen kann, z. B. ein RT-PCR-Gerät, um das beschriebene Protokoll durchzuführen. Wenn Sie SYPRO Orange verwenden, wie in diesem Protokoll beschrieben, verwenden Sie einen Scan-Modus, der eine Anregung um 470 nm und eine Emissionsdetektion um 570 nm ermöglicht. Programmieren Sie den Thermocycler so, dass er die Probe 2 Minuten lang bei 20 °C hält, gefolgt von einem Temperaturanstieg von 0,5 °C/1 min auf 95 °C; Messen Sie die Fluoreszenzintensität alle 1 °C.
   HINWEIS: Wir empfehlen einen optionalen Schritt am Ende des Zyklus, um den Probenblock wieder auf 20 °C zu bringen (Abbildung 1).
2. Jede Reaktion enthält vier Komponenten: Puffer, Protein of Interest, Additiv und extrinsischer Fluoreszenzfarbstoff. Gestalten Sie das Experiment so, dass es Kontrollen wie kein Protein, kein Farbstoff, Protein ohne Zusatzstoffe und nur Zusatzstoffe enthält, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen, die die Interpretation der Ergebnisse beeinflussen könnte. Falls verfügbar, fügen Sie eine Positivkontrolle hinzu, z. B. ein Additiv, von dem bekannt ist, dass es das interessierende Protein bindet und stabilisiert.
3. Verwenden Sie gereinigtes Protein für den Assay. Um diesem Beispiel zu folgen, verwenden Sie E. coli SelO, exprimiert und gereinigt wie zuvor beschrieben^25,29. Kurz gesagt, exprimieren Sie His-Sumo-markiertes SelO (E. coli SelO ppSumo) in Rosetta DE3-Zellen und reinigen Sie es mit Ni²⁺-NTA-Affinität. Spalten Sie den His-Sumo-Tag mit Hilfe der Ulp-Protease und reinigen Sie SelO durch Gelfiltrationschromatographie weiter.
4. Die Fluoreszenz von SYPRO Orange hängt von seiner Wechselwirkung mit dem interessierenden Protein ab. Da diese Wechselwirkungen von Protein zu Protein unterschiedlich sind, optimieren Sie die Protein- und Farbstoffkonzentration, um das maximale Signal-Rausch-Verhältnis des Fluoreszenzsignals zu erhalten.
   HINWEIS: SYPRO Orange ist nicht kompatibel mit einigen Proteinen und Zusatzstoffen wie z.B. Reinigungsmitteln^11,30. Zusätzliche extrinsische Farbstoffe, die unter ^{Nummer 12} aufgeführt sind, können bei Bedarf gescreent werden.

2. Bestimmung der optimalen Farbstoffkonzentration (Abbildung 2A)

1. Bereiten Sie 20-μl-Verdünnungen von 50x, 40x, 30x, 20x und 10x SYPRO Orange aus der Stammlösung vor, die mit 5.000x in DMSO bereitgestellt wird.
2. Geben Sie 8 μl 6,25 μM Protein, verdünnt in TSA-Puffer, in sechs separate Vertiefungen einer 384-Well-PCR-Platte.
   HINWEIS: In unserem Beispiel haben wir den folgenden TSA-Puffer verwendet, um die Verdünnungen durchzuführen: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl und 1 mM DTT. Die Proben können in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu verbessern.
3. Geben Sie 1 μl TSA-Puffer in jede Vertiefung.
   HINWEIS: Dieses Puffervolumen wird nach Optimierung der Farbstoff- und Proteinkonzentration durch die Zugabe kleiner Moleküle ersetzt.
4. Geben Sie 1 μl jeder seriellen Verdünnung der SYPRO Orange Farbstofflösung in jede Vertiefung. Geben Sie 1 μl Puffer ohne Farbstoff in die letzte Vertiefung, um die farbstofffreie Kontrolle zu gewährleisten.
5. Decken Sie die Platte mit optisch klarer Klebefolie ab.
6. Schleudern Sie die Platte 1 Minute lang kurz bei 1.000 × g in einer Zentrifuge, die mit einem PCR-Plattenadapter ausgestattet ist.
7. Legen Sie die Platte in ein RT-PCR-Gerät und starten Sie das in Schritt 1.1 beschriebene Thermocycling-Protokoll.

3. Bestimmung der optimalen Proteinkonzentration (Abbildung 2B)

1. Bereiten Sie 20 μl serielle Verdünnungen von 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM und 1,56 μM Protein unter Verwendung von TSA-Puffer (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl und 1 mM DTT) vor.
2. Geben Sie 8 μl serielle Verdünnungen des Proteins in fünf separate Vertiefungen einer 384-Well-Platte.
3. Geben Sie den Puffer nur in der 6^. Mulde gut ab, da keine Proteinkontrolle vorhanden ist.
4. Geben Sie 1 μl TSA-Puffer in jede Vertiefung.
   HINWEIS: Dieses Puffervolumen wird nach Optimierung der Farbstoff- und Proteinkonzentration durch die Zugabe kleiner Moleküle ersetzt.
5. Geben Sie 1 μl jeder 50x SYPRO Orange Farbstofflösung in jede Vertiefung.
6. Decken Sie die Platte mit optisch klarer Klebefolie ab.
7. Schleudern Sie die Platte 1 min lang kurz bei 1.000 × g in einer Zentrifuge, die mit einem PCR-Plattenadapter ausgestattet ist.
8. Legen Sie die Platte in ein RT-PCR-Gerät und starten Sie das in Schritt 1.1 beschriebene Thermocycling-Protokoll.

4. Einrichten eines TSA-Experiments (Abbildung 3A)

HINWEIS: Nach der Optimierung der Protein- und SYPRO Orange-Farbstoffkonzentrationen kann der Assay unter Zugabe der gewünschten kleinen Moleküle durchgeführt werden, um die Bindung zu analysieren.

1. Definieren Sie die Anzahl der Bedingungen unter Berücksichtigung der Replikate und der entsprechenden Kontrollen.
   HINWEIS: Zum Beispiel werden wir die Bindung von SelO an acht Bedingungen in dreifacher Ausfertigung testen. Einschließlich der Kontrollen (kein Zusatzstoff, kein Protein und kein Farbstoff) haben wir 11 Reaktionen x 3 (dreifach) = 33 Gesamtreaktionen.
2. Basierend auf der optimalen Konzentration von Protein und Farbstoff, die für SelO beobachtet wurde, stellen Sie sicher, dass jede Reaktion 8 μl 6,25 μM Protein, 1 μl Additiv und 1 μl 50x SYPRO Orange Farbstoff enthält, was einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl entspricht. Die verwendete Endkonzentration beträgt also 5 μM Protein und 5x SYPRO Orange Farbstoff.
3. Bereiten Sie 288 μl 6,25 μM Proteinlösung mit TSA-Puffer vor. Dieses Volumen der Proteinarbeitslösung macht 36 Reaktionen aus (33 Reaktionen mit zusätzlichen 10 % für Variationen beim Pipettieren).
4. Geben Sie 8 μl 6,25 μM Protein in separate Vertiefungen einer 384-Well-Platte. Dosieren Sie Puffer nur für die Null-Protein-Kontrolle.
5. Fügen Sie 1 μl kleine Moleküle in 10-facher Konzentration hinzu, um das endgültige 1-fache zu erreichen. Um diesem Beispiel zu folgen, fügen Sie 1 μl 20 mM MgCl₂ hinzu, um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Dosierpuffer nur für die No-Additiv-Steuerung.
6. Geben Sie 1 μl jeder 50x SYPRO Orange Farbstofflösung in jede Vertiefung.
7. Decken Sie die Platte mit optisch klarer Klebefolie ab.
8. Schleudern Sie die Platte 1 min lang kurz bei 1.000 × g in einer Zentrifuge, die mit einem PCR-Plattenadapter ausgestattet ist.
9. Legen Sie die Platte in ein RT-PCR-Gerät und starten Sie das in Schritt 1.1 beschriebene Thermocycling-Protokoll.

5. Datenanalyse

1. Exportieren Sie Daten aus dem RT-PCR-Gerät für relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) in Bezug auf die Temperatur (°C).
2. Verwenden Sie die Software Ihrer Wahl, um Datenpunkte bis zur höchsten gemessenen Intensität für jede Schmelzkurve zu extrahieren und darzustellen. Wichtig ist, dass Sie bestätigen, dass die Kontrollen ohne Protein und ohne Farbstoff eine geringe Hintergrundfluoreszenz ohne temperaturabhängigen Anstieg der Fluoreszenz aufweisen (Abbildung 3A, B und ergänzende Tabelle S1). Führen Sie Datenanalysen mit frei zugänglicher Software wie MoltenProt³¹ oder DSFWorld³² durch.
3. Bestimmen Sie die Schmelztemperatur mit Boltzmann Sigmoidal Fit für die Daten. Die Schmelztemperatur (T_m) ist definiert als die Temperatur, bei der eine Denaturierung von 50 % oder die halbe maximale Intensität beobachtet wird (Abbildung 3C).
4. Eine thermische Verschiebung in der Schmelzkurve kann auf stabilisierende oder destabilisierende Additive hindeuten. Um die Änderung der Schmelztemperatur (T_m) zu berechnen, verwenden Sie die Formel: T_m = T_m additiv _- T_m Puffer. Ein positiver Wert beschreibt einen stabilisierenden Zustand oder ein wechselwirkendes Additiv; ein negativer Wert beschreibt einen destabilisierenden Zustand (Abbildung 3D).

Ergebnisse

Eukaryotisches SelO besteht aus einer N-terminalen mitochondrialen Targeting-Sequenz, einer Kinase-ähnlichen Domäne und einem hochkonservierten Selenocystein am C-Terminus des Proteins²³. Dieses mitochondriale Enzym kodiert für eine Pseudokinase-Domäne, die von Bakterien auf den Menschen übertragen wurde²³. Die Strukturanalyse des SelO-Homologs aus Pseudomonas syringae ergab Aminosäureveränderungen im aktiven Zentrum, die di...

Diskussion

Der Thermal Shift Assay (TSA) dient als effiziente Methode zum Screening von Protein-Liganden-Wechselwirkungen, einschließlich solcher mit Cofaktoren und Inhibitoren. In diesem Protokoll haben wir TSA verwendet, um die Bindung der Pseudokinase SelO an Nukleotide und zweiwertige Kationen zu messen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass SelO in Gegenwart von ATP und Mg²⁺/Mn²⁺ eine erhöhte thermische Stabilität aufweist. Diese Beobachtung stimmt mit früheren Berichten üb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA