Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Zusammenfassung

Hier stellen wir den Thermal Shift Assay vor, eine fluoreszenzbasierte Hochdurchsatztechnik, mit der die Bindung kleiner Moleküle an interessante Proteine untersucht wird.

Zusammenfassung

Die Definition der biologischen Bedeutung von Proteinen mit unbekannten Funktionen stellt ein erhebliches Hindernis für das Verständnis zellulärer Prozesse dar. Obwohl bioinformatische und strukturelle Vorhersagen zur Untersuchung unbekannter Proteine beigetragen haben, werden experimentelle In-vitro-Validierungen oft durch die optimalen Bedingungen und Cofaktoren erschwert, die für die biochemische Aktivität erforderlich sind. Die Cofaktorbindung ist nicht nur für die Aktivität einiger Enzyme unerlässlich, sondern kann auch die thermische Stabilität des Proteins verbessern. Eine praktische Anwendung dieses Phänomens besteht darin, die Änderung der thermischen Stabilität, die durch Änderungen der Schmelztemperatur des Proteins gemessen wird, zu nutzen, um die Ligandenbindung zu sondieren.

Der Thermoshift-Assay (TSA) kann verwendet werden, um die Bindung verschiedener Liganden an das interessierende Protein zu analysieren oder einen stabilisierenden Zustand für die Durchführung von Experimenten wie der Röntgenkristallographie zu finden. Hier werden wir ein Protokoll für TSA beschreiben, das die Pseudokinase Selenoprotein O (SelO) für eine einfache Hochdurchsatzmethode zum Testen der Metall- und Nukleotidbindung verwendet. Im Gegensatz zu kanonischen Kinasen bindet SelO ATP in umgekehrter Orientierung, um den Transfer von AMP auf die Hydroxylseitenketten von Proteinen in einer posttranslationalen Modifikation, der sogenannten Protein-AMPylierung, zu katalysieren. Indem wir die Verschiebung der Schmelztemperaturen nutzen, liefern wir entscheidende Einblicke in die molekularen Wechselwirkungen, die der SelO-Funktion zugrunde liegen.

Einleitung

Ein Großteil des menschlichen Proteoms ist nach wie vor schlecht charakterisiert. Der von Dunham und Kustatscher et al. beschriebene "Straßenlaterneneffekt" bezieht sich auf das Phänomen, bei dem umfangreich erforschten Proteinen mehr Aufmerksamkeit geschenkt wird und wenig untersuchte Proteine übersehen werden ^1,2. Zu diesem Effekt tragen unter anderem die biologische Bedeutung und die Krankheitsrelevanz bestimmter Proteine bei. Darüber hinaus stimulieren frühere Forschungen, die grundlegendes Wissen bieten, sowie die Verfügbarkeit von Werkzeugen für die Funktionsanalyse die ....

Protokoll

1. Versuchsaufbau

1. Verwenden Sie einen Thermocycler, der Fluoreszenz nachweisen kann, z. B. ein RT-PCR-Gerät, um das beschriebene Protokoll durchzuführen. Wenn Sie SYPRO Orange verwenden, wie in diesem Protokoll beschrieben, verwenden Sie einen Scan-Modus, der eine Anregung um 470 nm und eine Emissionsdetektion um 570 nm ermöglicht. Programmieren Sie den Thermocycler so, dass er die Probe 2 Minuten lang bei 20 °C hält, gefolgt von einem Temperaturanstieg von 0,5 °C/1 min auf 95 °C; Messen Sie die Fluoreszenzintensität alle 1 °C.
   HINWEIS: Wir empfehlen einen optionalen Schritt am Ende des Zyklus, um den Pro....

Diskussion

Der Thermal Shift Assay (TSA) dient als effiziente Methode zum Screening von Protein-Liganden-Wechselwirkungen, einschließlich solcher mit Cofaktoren und Inhibitoren. In diesem Protokoll haben wir TSA verwendet, um die Bindung der Pseudokinase SelO an Nukleotide und zweiwertige Kationen zu messen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass SelO in Gegenwart von ATP und Mg²⁺/Mn²⁺ eine erhöhte thermische Stabilität aufweist. Diese Beobachtung stimmt mit früheren Berichten üb.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA