Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Riepilogo

Qui, presentiamo il saggio di spostamento termico, una tecnica ad alto rendimento basata sulla fluorescenza utilizzata per studiare il legame di piccole molecole alle proteine di interesse.

Abstract

Definire l'importanza biologica di proteine con funzioni sconosciute pone un ostacolo significativo nella comprensione dei processi cellulari. Sebbene le previsioni bioinformatiche e strutturali abbiano contribuito allo studio di proteine sconosciute, le validazioni sperimentali in vitro sono spesso ostacolate dalle condizioni ottimali e dai cofattori necessari per l'attività biochimica. Il legame del cofattore non è solo essenziale per l'attività di alcuni enzimi, ma può anche migliorare la stabilità termica della proteina. Un'applicazione pratica di questo fenomeno consiste nell'utilizzare il cambiamento di stabilità termica, misurato dalle alterazioni della temperatura di fusione della proteina, per sondare il legame del ligando.

Il saggio di spostamento termico (TSA) può essere utilizzato per analizzare il legame di diversi ligandi alla proteina di interesse o trovare una condizione stabilizzante per eseguire esperimenti come la cristallografia a raggi X. Qui descriveremo un protocollo per la TSA che utilizza la pseudochinasi, la Selenoproteina O (SelO), per un metodo semplice e ad alto rendimento per testare il legame di metalli e nucleotidi. A differenza delle chinasi canoniche, SelO lega l'ATP in un orientamento invertito per catalizzare il trasferimento di AMP alle catene laterali ossidriliche delle proteine in una modifica post-traduzionale nota come AMPilazione delle proteine. Sfruttando la variazione delle temperature di fusione, forniamo informazioni cruciali sulle interazioni molecolari alla base della funzione di SelO.

Introduzione

Gran parte del proteoma umano rimane scarsamente caratterizzato. L'"effetto lampione" descritto da Dunham e Kustatscher et al. si riferisce al fenomeno in cui le proteine ampiamente studiate ricevono maggiore attenzione, lasciando le proteine poco studiate trascurate ^1,2. I fattori che contribuiscono a questo effetto includono l'importanza biologica e la rilevanza per la malattia di alcune proteine. Inoltre, la ricerca precedente che offre conoscenze fondamentali, così come la disponibilità di strumenti per l'analisi funzionale, stimola ulteriormente la ricerca su

Protocollo

1. Configurazione sperimentale

1. Utilizzare un termociclatore in grado di rilevare la fluorescenza, come uno strumento RT-PCR, per eseguire il protocollo descritto. Se si utilizza SYPRO Orange, come descritto in questo protocollo, utilizzare una modalità di scansione che consenta l'eccitazione intorno a 470 nm e il rilevamento delle emissioni intorno a 570 nm. Programmare il termociclatore in modo che mantenga il campione a 20 °C per 2 minuti, seguito da un aumento della temperatura di 0,5 °C/1 min fino a 95 °C; misurare l'intensità della fluorescenza ogni 1 °C.
   NOTA: Si consiglia un passaggio facoltativo a....

Discussione

Il Thermal Shift Assay (TSA) funge da metodo efficiente per lo screening delle interazioni proteina-ligando, comprese quelle con cofattori e inibitori. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la TSA per misurare il legame della pseudochinasi SelO ai nucleotidi e ai cationi bivalenti. I nostri risultati mostrano che SelO mostra una maggiore stabilità termica in presenza di ATP e Mg²⁺/Mn²⁺. Questa osservazione si allinea con precedenti studi che indicano che gli omo.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA