Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Riepilogo

Qui, presentiamo il saggio di spostamento termico, una tecnica ad alto rendimento basata sulla fluorescenza utilizzata per studiare il legame di piccole molecole alle proteine di interesse.

Abstract

Definire l'importanza biologica di proteine con funzioni sconosciute pone un ostacolo significativo nella comprensione dei processi cellulari. Sebbene le previsioni bioinformatiche e strutturali abbiano contribuito allo studio di proteine sconosciute, le validazioni sperimentali in vitro sono spesso ostacolate dalle condizioni ottimali e dai cofattori necessari per l'attività biochimica. Il legame del cofattore non è solo essenziale per l'attività di alcuni enzimi, ma può anche migliorare la stabilità termica della proteina. Un'applicazione pratica di questo fenomeno consiste nell'utilizzare il cambiamento di stabilità termica, misurato dalle alterazioni della temperatura di fusione della proteina, per sondare il legame del ligando.

Il saggio di spostamento termico (TSA) può essere utilizzato per analizzare il legame di diversi ligandi alla proteina di interesse o trovare una condizione stabilizzante per eseguire esperimenti come la cristallografia a raggi X. Qui descriveremo un protocollo per la TSA che utilizza la pseudochinasi, la Selenoproteina O (SelO), per un metodo semplice e ad alto rendimento per testare il legame di metalli e nucleotidi. A differenza delle chinasi canoniche, SelO lega l'ATP in un orientamento invertito per catalizzare il trasferimento di AMP alle catene laterali ossidriliche delle proteine in una modifica post-traduzionale nota come AMPilazione delle proteine. Sfruttando la variazione delle temperature di fusione, forniamo informazioni cruciali sulle interazioni molecolari alla base della funzione di SelO.

Introduzione

Gran parte del proteoma umano rimane scarsamente caratterizzato. L'"effetto lampione" descritto da Dunham e Kustatscher et al. si riferisce al fenomeno in cui le proteine ampiamente studiate ricevono maggiore attenzione, lasciando le proteine poco studiate trascurate ^1,2. I fattori che contribuiscono a questo effetto includono l'importanza biologica e la rilevanza per la malattia di alcune proteine. Inoltre, la ricerca precedente che offre conoscenze fondamentali, così come la disponibilità di strumenti per l'analisi funzionale, stimola ulteriormente la ricerca su proteine altamente studiate ^1,2. Progetti come l'Understudy Proteins Initiative, lo Structural Genomics Consortium e l'Enzyme Function Initiative mirano a caratterizzare le proteine poco studiate utilizzando la proteomica strutturale e funzionale ^2,3,4. Un approccio complementare all'identificazione delle funzioni molecolari di proteine poco studiate consiste nell'esaminare le interazioni di queste proteine con piccole molecole per ottenere preziose informazioni sulla regolazione e sulla specificità del substrato.

Il legame di piccole molecole può aumentare la stabilità termica di una proteina⁵. Questo fenomeno, noto come stabilizzazione della conformazione indotta dal ligando, spesso provoca un aumento della temperatura di fusione di una proteina, fornendo un'indicazione misurabile del legame del ligando⁶. La stabilità termica di una proteina può essere misurata utilizzando la fluorimetria a scansione differenziale (DSF), nota anche come termofluor, o il saggio di spostamento termico (TSA)7,8,9,10. Nella TSA, un campione proteico è sottoposto a temperature crescenti in presenza di un colorante sensibile all'ambiente⁶. Mentre la proteina si dispiega e si denatura, il colorante si lega alle regioni idrofobiche esposte della proteina ed emette fluorescenza. I coloranti fluorescenti estrinseci, o coloranti sensibili all'ambiente, mancano di fluorescenza intrinseca e invece emettono fluorescenza dopo l'interazione con la loro molecola bersaglio ^9,11,12. Il colorante più comunemente usato, SYPRO Orange, offre diversi vantaggi come una maggiore stabilità e una fluorescenza di fondo minima ^8,9,12. In particolare, SYPRO Orange è compatibile con i sistemi di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) date le sue lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di circa 470 nm e 570 nm. Questa caratteristica unica consente di effettuare misurazioni ad alta produttività, accurate e sensibili, compatibili con i sistemi di rilevamento della fluorescenza comunemente utilizzati nei sistemi RT-PCR⁸.

La TSA è uno strumento versatile per studiare le interazioni proteiche con potenziali cofattori o farmaci e per identificare le condizioni stabilizzanti per la cristallografia. Alcuni dei suoi vantaggi rispetto ad altri metodi di screening sono la relativa semplicità di configurazione e l'elevata produttività con piastre da 96 o 384 pozzetti 13,14,15. Lo sviluppo di questa tecnica è stato trasformativo per gli studi di scoperta di farmaci, offrendo convenienza e consentendo lo studio di diversi additivi come ioni, ligandi e farmaci ^6,16. Inoltre, l'adattabilità della TSA ha incoraggiato gli scienziati ad espanderne l'utilità, facilitando la misurazione delle affinità di legame insieme ai test di screening^17,18. La TSA è uno strumento efficace negli studi di biologia strutturale per identificare le condizioni che promuovono la stabilizzazione della proteina di interesse per la cristallizzazione¹⁹. Pertanto, la sua flessibilità e relativa facilità hanno posizionato la TSA come una tecnica fondamentale nella caratterizzazione delle proteine. Qui, utilizzeremo la TSA per analizzare il legame di metalli e nucleotidi alla pseudochinasi poco studiata, la Selenoproteina O (SelO), come esempio.

Le chinasi sono una delle famiglie di proteine più bersaglio nella scoperta di farmaci²⁰. Si prevede che circa il 10% delle chinasi umane siano inattive e denominate pseudochinasi perché mancano dei residui catalitici chiave necessari per la catalisi^21,22. La selenoproteina O (SelO) è una pseudochinasi conservata evolutivamente che manca dell'aspartato conservato nel motivo catalitico HRD²³. Negli eucarioti, SelO si localizza nei mitocondri e protegge le cellule dallo stress ossidativo^24,25. Le analisi strutturali e biochimiche mostrano che SelO trasferisce l'adenosina monofosfato (AMP) dall'ATP ai substrati proteici in una modificazione post-traduzionale nota come^{AMPilazione 25}. Studi recenti indicano che gli enzimi che catalizzano l'AMPilazione possono legare nucleotidi alternativi come l'UTP in vitro^26,27. In particolare, gli studi hanno dimostrato che l'omologo SelO di Salmonella typhimurium catalizza l'UMPilazione proteica, o il trasferimento di UMP, in modo manganese-dipendente²⁸. Alla luce di queste interessanti osservazioni, testiamo il legame di SelO con ATP e UTP in presenza di magnesio e manganese, fungendo da esempio rappresentativo delle applicazioni della TSA. Il seguente protocollo può essere facilmente adattato per ottimizzare ed esaminare le interazioni di altre proteine e additivi di interesse.

Protocollo

1. Configurazione sperimentale

1. Utilizzare un termociclatore in grado di rilevare la fluorescenza, come uno strumento RT-PCR, per eseguire il protocollo descritto. Se si utilizza SYPRO Orange, come descritto in questo protocollo, utilizzare una modalità di scansione che consenta l'eccitazione intorno a 470 nm e il rilevamento delle emissioni intorno a 570 nm. Programmare il termociclatore in modo che mantenga il campione a 20 °C per 2 minuti, seguito da un aumento della temperatura di 0,5 °C/1 min fino a 95 °C; misurare l'intensità della fluorescenza ogni 1 °C.
   NOTA: Si consiglia un passaggio facoltativo alla fine del ciclo per riportare il blocco campione a 20 °C (Figura 1).
2. Ogni reazione contiene quattro componenti: tampone, proteina di interesse, additivo e colorante fluorescente estrinseco. Progettare l'esperimento in modo da includere controlli come nessuna proteina, nessun colorante, proteine senza additivi e solo additivi per determinare qualsiasi fluorescenza di fondo che possa influenzare l'interpretazione dei risultati. Se disponibile, includere un controllo positivo come un additivo noto per legare e stabilizzare la proteina di interesse.
3. Utilizzare proteine purificate per il saggio. Per seguire questo esempio, utilizzare E. coli SelO, espresso e purificato come precedentemente descritto^25,29. In breve, esprimere SelO marcato con His-sumo (E. coli SelO ppSumo) in cellule Rosetta DE3 e purificarlo utilizzando l'affinità Ni²⁺-NTA. Scindere il tag His-sumo utilizzando la proteasi Ulp e purificare ulteriormente SelO mediante cromatografia di filtrazione su gel.
4. La fluorescenza di SYPRO Orange dipenderà dalla sua interazione con la proteina di interesse. Poiché queste interazioni variano da proteina a proteina, ottimizzare la concentrazione di proteine e coloranti per ottenere il massimo rapporto segnale/rumore del segnale di fluorescenza.
   NOTA: SYPRO Orange non è compatibile con alcune proteine e additivi come i detersivi^11,30. Se necessario, possono essere sottoposti a screening ulteriori coloranti estrinseci elencati al ^{punto 12}.

2. Determinazione della concentrazione ottimale del colorante (Figura 2A)

1. Preparare diluizioni da 20 μl di SYPRO Orange 50x, 40x, 30x, 20x e 10x dalla soluzione madre, fornita a 5.000x in DMSO.
2. Erogare 8 μl di proteina da 6,25 μM diluita in tampone TSA in sei pozzetti separati di una piastra PCR da 384 pozzetti.
   NOTA: Nel nostro esempio, abbiamo utilizzato il seguente tampone TSA per eseguire le diluizioni: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl e 1 mM DTT. I campioni possono essere eseguiti in triplice copia per migliorare l'affidabilità dei risultati.
3. Aggiungere 1 μL di tampone TSA in ciascun pozzetto.
   NOTA: Questo volume di tampone sarà sostituito con l'aggiunta di piccole molecole dopo l'ottimizzazione della concentrazione di colorante e proteine.
4. Aggiungere 1 μl di ogni diluizione seriale della soluzione colorante SYPRO Orange a ciascun pozzetto. Aggiungere 1 μL di tampone senza colorante al pozzetto finale per il controllo senza colorante.
5. Coprire la piastra con una pellicola adesiva otticamente trasparente.
6. Far girare brevemente la piastra a 1.000 × g per 1 minuto in una centrifuga dotata di un adattatore per piastra PCR.
7. Posizionare la piastra in una macchina RT-PCR e avviare il protocollo di termociclo descritto al punto 1.1.

3. Determinazione della concentrazione proteica ottimale (Figura 2B)

1. Preparare 20 μL di diluizioni seriali di 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM e 1,56 μM di proteine utilizzando il tampone TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl e 1 mM DTT).
2. Erogare 8 μl di diluizioni seriali della proteina in cinque pozzetti separati di una piastra da 384 pozzetti.
3. Erogare il tampone solo nel 6^° pozzetto come controllo senza proteine.
4. Aggiungere 1 μL di tampone TSA in ciascun pozzetto.
   NOTA: Questo volume di tampone sarà sostituito con l'aggiunta di piccole molecole dopo l'ottimizzazione della concentrazione di colorante e proteine.
5. Aggiungere 1 μl di ogni soluzione di colorante SYPRO Orange 50x in ciascun pozzetto.
6. Coprire la piastra con una pellicola adesiva otticamente trasparente.
7. Far girare brevemente la piastra a 1.000 × g per 1 minuto in una centrifuga dotata di un adattatore per piastra PCR.
8. Posizionare la piastra in una macchina RT-PCR e avviare il protocollo di termociclo descritto al punto 1.1.

4. Impostazione di un esperimento TSA (Figura 3A)

NOTA: Dopo l'ottimizzazione delle concentrazioni proteiche e del colorante SYPRO Orange, il test può essere eseguito con l'aggiunta delle piccole molecole desiderate per analizzare il legame.

1. Definire il numero di condizioni considerando le repliche e i controlli adeguati.
   NOTA: Ad esempio, testeremo il legame di SelO a otto condizioni in triplice copia. Compresi i controlli (nessun additivo, nessuna proteina e nessun colorante), abbiamo 11 reazioni x 3 (triplicato) = 33 reazioni totali.
2. Sulla base della concentrazione ottimale di proteine e coloranti osservata per SelO, assicurarsi che ogni reazione contenga 8 μL di proteina 6,25 μM, 1 μL di additivo e 1 μL di colorante SYPRO Orange 50x per un volume di reazione totale di 10 μL. Pertanto, la concentrazione finale utilizzata è di 5 μM di proteina e 5x di colorante SYPRO Orange.
3. Preparare 288 μL di soluzione proteica da 6,25 μM utilizzando il tampone TSA. Questo volume di soluzione di lavoro proteica rappresenta 36 reazioni (33 reazioni con un ulteriore 10% per variazioni nel pipettaggio).
4. Erogare 8 μl di proteina da 6,25 μM in pozzetti separati di una piastra da 384 pozzetti. Erogare il tampone solo per il controllo senza proteine.
5. Aggiungere 1 μL di piccole molecole a una concentrazione di 10x per ottenere 1x finale. Per seguire questo esempio, aggiungere 1 μL di 20 mM MgCl₂ per ottenere una concentrazione finale di 2 mM. Erogare il tampone solo per il controllo senza additivi.
6. Aggiungere 1 μl di ogni soluzione di colorante SYPRO Orange 50x in ciascun pozzetto.
7. Coprire la piastra con una pellicola adesiva otticamente trasparente.
8. Far girare brevemente la piastra a 1.000 × g per 1 minuto in una centrifuga dotata di un adattatore per piastra PCR.
9. Posizionare la piastra in una macchina RT-PCR e avviare il protocollo di termociclo descritto al punto 1.1.

5. Analisi dei dati

1. Esportazione dei dati dalla macchina RT-PCR per le unità di fluorescenza relative (RFU) rispetto alla temperatura (°C).
2. Utilizza il software che preferisci per estrarre e tracciare i punti dati fino all'intensità massima misurata per ogni curva di fusione. È importante confermare che i controlli senza proteine e senza colorante mostrano una bassa fluorescenza di fondo senza aumenti della fluorescenza dipendenti dalla temperatura (Figura 3A, B e Tabella supplementare S1). Esegui l'analisi dei dati utilizzando software liberamente accessibili come MoltenProt³¹ o DSFWorld³².
3. Determinare la temperatura di fusione utilizzando Boltzmann Sigmoidal Fit per i dati. La temperatura di fusione (T_m) è definita come la temperatura alla quale si osserva una denaturazione del 50% o metà dell'intensità massima (Figura 3C).
4. Uno spostamento termico nella curva di fusione può suggerire additivi stabilizzanti o destabilizzanti. Per calcolare la variazione della temperatura di fusione (T_m), utilizzare la formula: T_m= T_m additivo_- T_m tampone. Un valore positivo descrive una condizione stabilizzante o un additivo interagente; un valore negativo descrive una condizione destabilizzante (Figura 3D).

Risultati

La SelO eucariotica è costituita da una sequenza di targeting mitocondriale N-terminale, da un dominio simile alla chinasi e da una selenocisteina altamente conservata al C-terminale della proteina²³. Questo enzima residente nei mitocondri codifica per un dominio pseudochinasico che viene conservato dai batteri all'uomo²³. L'analisi strutturale dell'omologo SelO di Pseudomonas syringae ha rivelato alterazioni aminoacidiche nel sit...

Discussione

Il Thermal Shift Assay (TSA) funge da metodo efficiente per lo screening delle interazioni proteina-ligando, comprese quelle con cofattori e inibitori. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la TSA per misurare il legame della pseudochinasi SelO ai nucleotidi e ai cationi bivalenti. I nostri risultati mostrano che SelO mostra una maggiore stabilità termica in presenza di ATP e Mg²⁺/Mn²⁺. Questa osservazione si allinea con precedenti studi che indicano che gli omo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA