АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы представляем анализ теплового сдвига, высокопроизводительный флуоресцентный метод, используемый для исследования связывания малых молекул с белками, представляющими интерес.

Аннотация

Определение биологической важности белков с неизвестными функциями представляет собой значительное препятствие в понимании клеточных процессов. Несмотря на то, что биоинформатические и структурные прогнозы внесли свой вклад в изучение неизвестных белков, экспериментальные проверки in vitro часто затрудняются оптимальными условиями и кофакторами, необходимыми для биохимической активности. Связывание кофактора не только необходимо для активности некоторых ферментов, но также может повысить термическую стабильность белка. Одно из практических применений этого явления заключается в использовании изменения термической стабильности, измеряемой изменениями температуры плавления белка, для зондирования связывания лигандов.

Анализ теплового сдвига (TSA) может быть использован для анализа связывания различных лигандов с интересующим белком или для поиска стабилизирующего условия для проведения таких экспериментов, как рентгеновская кристаллография. Здесь мы опишем протокол ТСА с использованием псевдокиназы, селенопротеина О (SelO), для простого и высокопроизводительного метода тестирования связывания металлов и нуклеотидов. В отличие от канонических киназ, SelO связывается с АТФ в инвертированной ориентации, чтобы катализировать перенос АМФ к гидроксильным боковым цепям белков в посттрансляционной модификации, известной как АМПилирование белка. Используя сдвиг в температурах плавления, мы получаем важнейшее представление о молекулярных взаимодействиях, лежащих в основе функции SelO.

Введение

Большая часть протеома человека остается плохо охарактеризованной. «Эффект уличного фонаря», описанный Данхэмом и Кустатшером и др., относится к явлению, при котором широко исследованные белки получают больше внимания, оставляя малоизученные белки незамеченными 1,2. Факторы, способствующие этому эффекту, включают биологическую важность и актуальность определенных белков для заболевания. Более того, предварительные исследования, которые предлагают фундаментальные знания, а также наличие инструментов для функционального анализа, еще больше стимулируют исследования хорошо изученных белков 1,2. Такие проекты, как Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium и Enzyme Function Initiative, направлены на характеристику малоизученных белков с использованием структурной и функциональной протеомики 2,3,4. Дополнительным подходом к идентификации молекулярных функций недостаточно изученных белков является изучение взаимодействий этих белков с малыми молекулами для получения ценной информации о регуляции и специфичности субстрата.

Связывание малых молекул может повысить термическую стабильность белка5. Это явление, известное как индуцированная лигандом конформационная стабилизация, часто приводит к увеличению температуры плавления белка, что дает измеримое указание на связывание лиганда6. Термическая стабильность белка может быть измерена с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF), также известной как термофтор, или анализа теплового сдвига (TSA)7,8,9,10. При АСП образец белка подвергают повышению температуры в присутствии экологически чувствительного красителя6. По мере того, как белок разворачивается и денатурируется, краситель связывается с обнаженными гидрофобными областями белка и излучает флуоресценцию. Внешние флуоресцентные красители, или экологически чувствительные красители, не имеют собственной флуоресценции и вместо этого флуоресцируют при взаимодействии со своей целевой молекулой 9,11,12. Наиболее часто используемый краситель, SYPRO Orange, обладает рядом преимуществ, таких как повышенная стабильность и минимальная фоновая флуоресценция 8,9,12. Примечательно, что SYPRO Orange совместим с системами полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР), учитывая его длины волн возбуждения и излучения около 470 нм и 570 нм соответственно. Эта уникальная функция позволяет проводить высокопроизводительные, точные и чувствительные измерения, совместимые с системами обнаружения флуоресценции, обычно используемыми в системах ОТ-ПЦР8.

TSA является универсальным инструментом для исследования взаимодействия белков с потенциальными кофакторами или лекарственными препаратами, а также для определения стабилизирующих условий для кристаллографии. Некоторые из его преимуществ по сравнению с другими методами грохочения заключаются в относительной простоте настройки и высокой производительности при использовании 96- или 384-луночных планшетов 13,14,15. Разработка этого метода стала преобразующим для исследований по открытию лекарств, обеспечивая удобство и позволяя изучать различные добавки, такие как ионы, лиганды и лекарства 6,16. Более того, адаптивность TSA побудила ученых расширить его применение, облегчая измерение аффинностей связывания наряду со скрининговыми анализами17,18. TSA является эффективным инструментом в исследованиях структурной биологии для выявления условий, способствующих стабилизации белка, представляющего интерес для кристаллизации19. Таким образом, его гибкость и относительная легкость сделали TSA краеугольным камнем в определении характеристик белков. Здесь мы будем использовать TSA для анализа связывания металлов и нуклеотидов с малоизученной псевдокиназой, селенопротеином О (SelO), в качестве примера.

Киназы являются одним из наиболее целевых семейств белков в Drug Discovery20. Предполагается, что примерно 10% киназ человека являются неактивными и называются псевдокиназами, поскольку в них отсутствуют ключевые каталитические остатки, необходимые для катализа21,22. Селенопротеин О (SelO) является эволюционно консервативной псевдокиназой, в которой отсутствует консервативный аспартат, присутствующий в каталитическом мотиве HRD23. У эукариот SelO локализуется в митохондриях и защищает клетки от окислительного стресса24,25. Структурный и биохимический анализы показывают, что SelO переносит аденозинмонофосфат (АМФ) из АТФ в белковые субстраты в посттрансляционной модификации, известной как АМПилирование25. Недавние исследования показывают, что ферменты, катализирующие АМПиляцию, могут связываться с альтернативными нуклеотидами, такими как UTP in vitro26,27. В частности, исследования показали, что гомолог SelO из Salmonella typhimurium катализирует белковое UMPylation, или перенос UMP, марганец-зависимым образом28. Учитывая эти интригующие наблюдения, мы протестировали связывание SelO с АТФ и УТФ в присутствии магния и марганца, что служит репрезентативным примером применения TSA. Следующий протокол может быть легко адаптирован для оптимизации и изучения взаимодействий других белков и добавок, представляющих интерес.

протокол

1. Экспериментальная установка

  1. Используйте термоамплификатор, который может обнаруживать флуоресценцию, например, инструмент ОТ-ПЦР, для выполнения описанного протокола. При использовании SYPRO Orange, как описано в этом протоколе, используйте режим сканирования, который позволяет возбуждать около 470 нм и обнаруживать излучение около 570 нм. Запрограммируйте термоамплификатор на удержание образца при температуре 20 °C в течение 2 мин с последующим повышением температуры на 0,5 °C/1 мин до 95 °C; измерять интенсивность флуоресценции каждые 1 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выполнить необязательный шаг в конце цикла, чтобы вернуть блок образца к температуре 20 °C (Рисунок 1).
  2. Каждая реакция содержит четыре компонента: буфер, представляющий интерес, добавку и внешний флуоресцентный краситель. Спланируйте эксперимент таким образом, чтобы включить в него такие элементы управления, как отсутствие белка, отсутствие красителя, белок без добавок и только добавки, чтобы определить любую фоновую флуоресценцию, которая может повлиять на интерпретацию результатов. Если это возможно, включите положительный контроль, такой как добавка, которая, как известно, связывает и стабилизирует интересующий белок.
  3. Для анализа используйте очищенный белок. Чтобы следовать этому примеру, используйте E. coli SelO, экспрессированную и очищенную, как описано ранее25,29. Вкратце, экспрессируйте His-сумо, помеченный SelO (E. coli SelO ppSumo) в клетках Rosetta DE3 и очищайте его с помощью сродства Ni2+-NTA. Расщепите бирку His-сумо с помощью протеазы Ulp и дополнительно очистите SelO с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
  4. Флуоресценция SYPRO Orange будет зависеть от его взаимодействия с интересующим белком. Поскольку эти взаимодействия будут варьироваться от белка к белку, оптимизируйте концентрацию белка и красителя для получения максимального сигнала от сигнала к шуму флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SYPRO Orange не совместим с некоторыми белками и добавками, такими как моющие средства11,30. Дополнительные внешние красители, перечисленные в пункте 12, могут быть проверены по мере необходимости.

2. Определение оптимальной концентрации красителя (рисунок 2А)

  1. Приготовьте 20 мкл разведений 50x, 40x, 30x, 20x и 10x SYPRO Orange из исходного раствора, который содержится в 5000-кратном содержании ДМСО.
  2. Диспонируйте 8 мкл белка 6,25 μM, разведенного в буфере TSA, в шесть отдельных лунок 384-луночного ПЦР-планшета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем примере мы использовали следующий буфер TSA для выполнения разведений: 10 мМ Tris pH 8, 150 мМ NaCl и 1 мМ DTT. Выборки могут быть запущены в трех экземплярах для повышения надежности результатов.
  3. Добавьте по 1 мкл буфера TSA в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем буфера будет заменен добавлением малых молекул после оптимизации концентрации красителя и белка.
  4. Добавьте по 1 мкл каждого серийного разбавления раствора оранжевого красителя SYPRO в каждую лунку. Добавьте 1 мкл буфера без красителя в конечную лунку для контроля отсутствия красителя.
  5. Накройте тарелку оптически прозрачной клейкой пленкой.
  6. Кратковременно опустите планшет при 1000 × г в течение 1 минуты в центрифуге, оснащенной адаптером для ПЦР-планшета.
  7. Поместите планшет в аппарат для ОТ-ПЦР и запустите протокол термоциклирования, описанный в шаге 1.1.

3. Определение оптимальной концентрации белка (рисунок 2В)

  1. Приготовьте 20 мкл последовательных разведений 25 мкМ, 12,5 мкМ, 6,25 мкМ, 3,125 мкМ и 1,56 мкМ белка с использованием буфера TSA (10 мМ Tris pH 8, 150 мМ NaCl и 1 мМ DTT).
  2. Диспенсируйте 8 мкл последовательных разведений белка в пять отдельных лунок 384-луночного планшета.
  3. Дозируйте буфер только на6-й уровень, а также без контроля белка.
  4. Добавьте по 1 мкл буфера TSA в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем буфера будет заменен добавлением малых молекул после оптимизации концентрации красителя и белка.
  5. Добавьте по 1 мкл каждого 50-кратного раствора оранжевого красителя SYPRO в каждую лунку.
  6. Накройте тарелку оптически прозрачной клейкой пленкой.
  7. Кратковременно уменьшите температуру планшета при 1000 × g в течение 1 минуты в центрифуге, оснащенной адаптером для ПЦР-планшета.
  8. Поместите планшет в аппарат для ОТ-ПЦР и запустите протокол термоциклирования, описанный в шаге 1.1.

4. Постановка эксперимента TSA (Рисунок 3A)

ПРИМЕЧАНИЕ: После оптимизации концентрации белка и оранжевого красителя SYPRO, анализ может быть выполнен с добавлением желаемых малых молекул для анализа связывания.

  1. Определите количество условий, учитывая репликации и адекватные элементы управления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, мы проверим связывание SelO с восемью условиями в трех экземплярах. Включая контрольную группу (без добавки, без белка и без красителя), мы имеем 11 реакций x 3 (трипликативные) = 33 всего реакции.
  2. Основываясь на оптимальной концентрации белка и красителя, наблюдаемой для SelO, убедитесь, что каждая реакция содержит 8 мкл белка 6,25 мкм, 1 л добавки и 1 мкл 50x оранжевого красителя SYPRO, что в сумме составляет 10 мкл реакционного объема. Таким образом, конечная используемая концентрация составляет 5 мкМ белка и 5x оранжевый краситель SYPRO.
  3. Приготовьте 288 мкл раствора белка 6,25 мкМ с использованием буфера TSA. На этот объем рабочего раствора белка приходится 36 реакций (33 реакции с дополнительными 10% на вариации пипетирования).
  4. Диспонируйте 8 мкл белка 6,25 мкМ в отдельные лунки 384-луночного планшета. Выдавайте буфер только для контроля отсутствия белка.
  5. Добавьте 1 мкл малых молекул в 10-кратной концентрации, чтобы получить окончательный 1-кратный концентрацию. Чтобы следовать этому примеру, добавьте 1 мкл 20 мМ MgCl2для достижения конечной концентрации 2 мМ. Дозируйте буфер только для контроля без добавок.
  6. Добавьте по 1 мкл каждого 50-кратного раствора оранжевого красителя SYPRO в каждую лунку.
  7. Накройте тарелку оптически прозрачной клейкой пленкой.
  8. Кратковременно уменьшите температуру планшета при 1000 × g в течение 1 минуты в центрифуге, оснащенной адаптером для ПЦР-планшета.
  9. Поместите планшет в аппарат для ОТ-ПЦР и запустите протокол термоциклирования, описанный в шаге 1.1.

5. Анализ данных

  1. Экспорт данных с аппарата ОТ-ПЦР для единиц относительной флуоресценции (RFU) по отношению к температуре (°C).
  2. Используйте выбранное программное обеспечение для извлечения и построения графиков точек данных с точностью до самой высокой интенсивности, измеренной для каждой кривой плавления. Важно подтвердить, что контрольные группы без белка и красителя демонстрируют низкую фоновую флуоресценцию без температурно-зависимого увеличения флуоресценции (рис. 3A, B и дополнительная таблица S1). Выполняйте анализ данных с помощью свободно доступного программного обеспечения, такого как MoltenProt31 или DSFWorld32.
  3. Определите температуру плавления с помощью сигмоидальной подгонки Больцмана. Температура плавления (Tm) определяется как температура, при которой наблюдается 50% денатурации или половина максимальной интенсивности (Рисунок 3C).
  4. Тепловой сдвиг на кривой плавления может указывать на стабилизирующие или дестабилизирующие добавки. Для расчета изменения температуры плавления (Tm) используется формула: Tm= Tm добавка - Tm буфер. Положительное значение описывает стабилизирующее состояние или взаимодействующую добавку; отрицательное значение описывает дестабилизирующее состояние (рисунок 3D).

Результаты

Эукариотический SelO состоит из N-концевой митохондриальной последовательности, киназоподобного домена и высококонсервативного селеноцистеина на С-конце белка23. Этот митохондриально-резидентный фермент кодирует домен псевдокиназы, который сохраняется ...

Обсуждение

Анализ теплового сдвига (TSA) служит эффективным методом скрининга белок-лигандных взаимодействий, в том числе с кофакторами и ингибиторами. В этом протоколе мы использовали TSA для измерения связывания псевдокиназы SelO с нуклеотидами и двухвалентными катионами. Наши ре...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

А.С. является научным сотрудником У.В. Карута-младшего в области биомедицинских исследований, стипендиатом Института профилактики рака и исследований Техаса (CPRIT), а также научным сотрудником факультета Центра минерального метаболизма и клинических исследований Чарльза и Джейн Пак. Эта работа была поддержана NIH Grant K01DK123194 (A.S.), CPRIT Grant RR190106 (A.S.), Welch (I-2046-20200401) и Welch (I-2046-20230405).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigma AldrichA2383-10Gused for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assemblyBeckman CoulterC19416
CFX Opus 384 Real-time PCR systemBio-Rad12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/whiteBio-RadHSP3805
Magnesium ChlorideSigma AldrichM8266-100Gused for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrateSigma AldrichM3634-500Gused for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, opticalBio-RadMSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stainSigma AldrichS5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrateSigma AldrichU6625-100MGused for representative results but not required to perfom TSA

Ссылки

  1. Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034 (2018).
  2. Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
  3. Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19 (2014).
  4. Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018 (2023).
  5. Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
  6. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  7. Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).
  8. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  9. Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , (2023).
  10. Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688 (2023).
  11. Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
  12. Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
  13. Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
  14. Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
  15. Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
  16. Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
  17. Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650 (2019).
  18. Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), e51809 (2014).
  19. Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
  20. Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894 (2024).
  21. Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
  22. Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
  23. Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138 (2012).
  24. Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518 (2014).
  25. Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821 (2018).
  26. Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279 (2023).
  27. Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).
  28. Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161 (2020).
  29. Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
  30. Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024 (2017).
  31. Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
  32. Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022 (2024).
  33. Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, 209-214 (2013).
  34. Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), (2019).
  35. Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
  36. Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
  37. Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены