Использование анализа теплового сдвига для зондирования связывания субстрата с селенопротеином O

Резюме

В данной работе мы представляем анализ теплового сдвига, высокопроизводительный флуоресцентный метод, используемый для исследования связывания малых молекул с белками, представляющими интерес.

Аннотация

Определение биологической важности белков с неизвестными функциями представляет собой значительное препятствие в понимании клеточных процессов. Несмотря на то, что биоинформатические и структурные прогнозы внесли свой вклад в изучение неизвестных белков, экспериментальные проверки in vitro часто затрудняются оптимальными условиями и кофакторами, необходимыми для биохимической активности. Связывание кофактора не только необходимо для активности некоторых ферментов, но также может повысить термическую стабильность белка. Одно из практических применений этого явления заключается в использовании изменения термической стабильности, измеряемой изменениями температуры плавления белка, для зондирования связывания лигандов.

Анализ теплового сдвига (TSA) может быть использован для анализа связывания различных лигандов с интересующим белком или для поиска стабилизирующего условия для проведения таких экспериментов, как рентгеновская кристаллография. Здесь мы опишем протокол ТСА с использованием псевдокиназы, селенопротеина О (SelO), для простого и высокопроизводительного метода тестирования связывания металлов и нуклеотидов. В отличие от канонических киназ, SelO связывается с АТФ в инвертированной ориентации, чтобы катализировать перенос АМФ к гидроксильным боковым цепям белков в посттрансляционной модификации, известной как АМПилирование белка. Используя сдвиг в температурах плавления, мы получаем важнейшее представление о молекулярных взаимодействиях, лежащих в основе функции SelO.

Введение

Большая часть протеома человека остается плохо охарактеризованной. «Эффект уличного фонаря», описанный Данхэмом и Кустатшером и др., относится к явлению, при котором широко исследованные белки получают больше внимания, оставляя малоизученные белки незамеченными ^1,2. Факторы, способствующие этому эффекту, включают биологическую важность и актуальность определенных белков для заболевания. Более того, предварительные исследования, которые предлагают фундаментальные знания, а также наличие инструментов для функционального анализа, еще больше стимулируют исследования хорошо изученн....

протокол

1. Экспериментальная установка

1. Используйте термоамплификатор, который может обнаруживать флуоресценцию, например, инструмент ОТ-ПЦР, для выполнения описанного протокола. При использовании SYPRO Orange, как описано в этом протоколе, используйте режим сканирования, который позволяет возбуждать около 470 нм и обнаруживать излучение около 570 нм. Запрограммируйте термоамплификатор на удержание образца при температуре 20 °C в течение 2 мин с последующим повышением температуры на 0,5 °C/1 мин до 95 °C; измерять интенсивность флуоресценции каждые 1 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выполнить необязательный шаг в ко....

Результаты

Эукариотический SelO состоит из N-концевой митохондриальной последовательности, киназоподобного домена и высококонсервативного селеноцистеина на С-конце белка²³. Этот митохондриально-резидентный фермент кодирует домен псевдокиназы, который сохраняется .......

Обсуждение

Анализ теплового сдвига (TSA) служит эффективным методом скрининга белок-лигандных взаимодействий, в том числе с кофакторами и ингибиторами. В этом протоколе мы использовали TSA для измерения связывания псевдокиназы SelO с нуклеотидами и двухвалентными катионами. Наши ре.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA