Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Özet

Burada, küçük moleküllerin ilgilenilen proteinlere bağlanmasını araştırmak için kullanılan yüksek verimli, floresan tabanlı bir teknik olan termal kayma testini sunuyoruz.

Özet

Bilinmeyen işlevlere sahip proteinlerin biyolojik önemini tanımlamak, hücresel süreçlerin anlaşılmasında önemli bir engel teşkil etmektedir. Biyoinformatik ve yapısal tahminler bilinmeyen proteinlerin çalışmasına katkıda bulunmuş olsa da, in vitro deneysel doğrulamalar genellikle biyokimyasal aktivite için gerekli olan optimal koşullar ve kofaktörler tarafından engellenir. Kofaktör bağlanması sadece bazı enzimlerin aktivitesi için gerekli değildir, aynı zamanda proteinin termal stabilitesini de artırabilir. Bu fenomenin pratik bir uygulaması, proteinin erime sıcaklığındaki değişikliklerle ölçülen termal stabilitedeki değişikliğin, ligand bağlanmasını araştırmak için kullanılmasında yatmaktadır.

Termal kayma testi (TSA), farklı ligandların ilgilenilen proteine bağlanmasını analiz etmek veya X-ışını kristalografisi gibi deneyler yapmak için stabilize edici bir koşul bulmak için kullanılabilir. Burada, metal ve nükleotid bağlanmasını test etmek için basit ve yüksek verimli bir yöntem için psödokinaz, Selenoprotein O (SelO) kullanan TSA için bir protokol açıklayacağız. Kanonik kinazların aksine, SelO, protein AMPilasyonu olarak bilinen posttranslasyonel bir modifikasyonda AMP'nin proteinlerin hidroksil yan zincirlerine transferini katalize etmek için ATP'yi ters çevrilmiş bir oryantasyonda bağlar. Erime sıcaklıklarındaki değişimden yararlanarak, SelO fonksiyonunun altında yatan moleküler etkileşimler hakkında önemli bilgiler sağlıyoruz.

Giriş

İnsan proteomunun çoğu zayıf bir şekilde karakterize edilmiştir. Dunham ve Kustatscher ve arkadaşları tarafından tanımlanan "sokak lambası etkisi", kapsamlı bir şekilde araştırılmış proteinlerin daha fazla dikkat çektiği ve az çalışılmış proteinlerin göz ardı edildiği fenomeni ifade eder ^1,2. Bu etkiye katkıda bulunan faktörler arasında bazı proteinlerin biyolojik önemi ve hastalık ilgisi yer alır. Ayrıca, temel bilgileri sunan önceki araştırmaların yanı sıra fonksiyonel analiz için araçların mevcudiyeti, çok çalışılmış proteinler ^1,2

Protokol

1. Deney düzeneği

1. Açıklanan protokolü gerçekleştirmek için RT-PCR cihazı gibi floresansı algılayabilen bir termal döngüleyici kullanın. Bu protokolde açıklandığı gibi SYPRO Orange kullanılıyorsa, 470 nm civarında uyarma ve 570 nm civarında emisyon algılamaya izin veren bir tarama modu kullanın. Termodöngüleyiciyi, numuneyi 20 °C'de 2 dakika tutacak ve ardından sıcaklıkta 0,5 °C/1 dk'lık bir sıcaklık artışı ile 95 °C'ye kadar programlayın; floresan yoğunluğunu her 1 °C'de bir ölçün.
   NOT: S'yi döndürmek için döngünün sonunda isteğe bağlı bir adım öneririz.ampbloğu 20 °C'ye getirin (Şeki....

Tartışmalar

Termal Kayma Testi (TSA), kofaktörler ve inhibitörler dahil olmak üzere protein-ligand etkileşimlerini taramak için etkili bir yöntem olarak hizmet eder. Bu protokolde, psödokinaz SelO'nun nükleotidlere ve iki değerlikli katyonlara bağlanmasını ölçmek için TSA'yı kullandık. Bulgularımız, SelO'nun ATP ve Mg^{2 +} / Mn^{2 +} varlığında artan termal stabilite sergilediğini göstermektedir. Bu gözlem, E. coli, S. cerevisiae ve H. sapiens't.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA