Medición de cuatro subtipos de células NK uterinas mediante tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada en mujeres con fallo de implantación repetido

Resumen

Este estudio presenta un método pionero para cuantificar subconjuntos de células asesinas naturales uterinas durante la ventana de implantación utilizando técnicas avanzadas de tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada.

Resumen

La inmunohistoquímica (IHQ) desempeña un papel crucial en la investigación biológica y el diagnóstico clínico, ya que es el método más utilizado para identificar y visualizar los antígenos tisulares. Sin embargo, los métodos tradicionales de tinción con IHQ tienen limitaciones para distinguir varios subtipos de células inmunitarias. Este desafío ha llevado a los científicos a explorar nuevas tecnologías y metodologías para la identificación y diferenciación precisas de subtipos de células inmunitarias. En los últimos años, la IHC multiplex ha surgido como una solución, permitiendo la detección simultánea de múltiples antígenos y su visualización dentro de la misma muestra de tejido. Las células asesinas naturales uterinas (uNK) desempeñan un papel fundamental en los procesos tempranos del embarazo, incluida la decidualización, la remodelación de las arterias espirales uterinas y la implantación del embrión. Los diferentes subtipos de células uNK exhiben diferentes funciones, lo que les permite coordinar varios eventos biológicos para el desarrollo exitoso del embrión y el embarazo. Por lo tanto, la investigación en profundidad sobre los subtipos de células uNK es esencial para dilucidar los mecanismos de regulación inmunitaria durante el embarazo. Estos estudios proporcionan información valiosa y enfoques novedosos para abordar afecciones relacionadas, como la infertilidad y el fracaso reproductivo recurrente. En este artículo se presenta un protocolo detallado de tinción de IHQ multiplex para estudiar la densidad de cuatro subtipos de células uNK en muestras endometriales durante la ventana de implantación (WOI). El protocolo incluye la preparación de muestras, la optimización de marcadores de subtipos, imágenes microscópicas y análisis de datos. Este protocolo de tinción múltiple de IHC ofrece una alta especificidad y sensibilidad, lo que permite la detección simultánea de diferentes subtipos de células uNK, proporcionando así a los investigadores una poderosa herramienta para explorar las complejidades y los mecanismos de la regulación inmunitaria durante el embarazo.

Introducción

El primer nacido vivo documentado después de la fertilización in vitro-transferencia de embriones (FIV-ET) se reportó en 1978. En los últimos 40 años, ha habido una gran demanda de asistencia a la FIV-ET entre las parejas infértiles¹. En 2021, 238,126 pacientes iniciaron un total de 413,776 ciclos de FIV en los Estados Unidos. Esto marca un aumento del 25% en los ciclos con respecto a los 2 años anteriores y un aumento del 135% con respecto a 2012². Este aumento se atribuye principalmente al aumento de la prevalencia de la infertilidad y al retraso en la planificación del embara....

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica del Clúster Este de la Universidad China Conjunta de Hong Kong-Nuevos Territorios (CREC ref no.: 2022.581). Las mujeres con RIF fueron reclutadas en el Centro de Tecnología de Reproducción Asistida del Hospital Príncipe de Gales de la Universidad China de Hong Kong. El RIF se definió como la imposibilidad de lograr un embarazo clínico después de la transferencia de al menos 4 embriones de buena calidad en un mínimo de 3 ciclos frescos o congelados en una mujer menor de 40 años¹⁰. Se obtuvo el consentimiento informado de las participantes an....

Discusión

La implantación embrionaria implica una interacción compleja entre el embrión y el endometrio. El estado inmunológico de la homeostasis endometrial desempeña un papel fundamental en la determinación de la receptividad endometrial. Durante la WOI, la población de leucocitos predominante en el endometrio son las células NK. Aproximadamente el 90% de las células uNK exhiben una alta expresión de CD56 pero carecen de CD16. Sin embargo, un subconjunto menor de células uNK se asemej.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining