قياس أربعة أنواع فرعية من الخلايا القاتلة الطبيعية الرحمية باستخدام تلطيخ كيميائي مناعي فلوري متعدد الإرسال لدى النساء المصابات بفشل الزرع المتكرر

Summary

تقدم هذه الدراسة طريقة رائدة لقياس المجموعات الفرعية للخلايا القاتلة الطبيعية للرحم أثناء فترة الزرع باستخدام تقنيات تلطيخ كيميائية مناعية فلورية متقدمة متعددة الإرسال.

Abstract

تلعب الكيمياء المناعية (IHC) دورا مهما في البحث البيولوجي والتشخيص السريري ، حيث تعمل كالطريقة الأكثر استخداما لتحديد مستضدات الأنسجة وتصورها. ومع ذلك ، فإن طرق تلطيخ IHC التقليدية لها قيود في التمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا المناعية. دفع هذا التحدي العلماء إلى استكشاف تقنيات ومنهجيات جديدة للتحديد الدقيق والتمييز الدقيق للأنواع الفرعية للخلايا المناعية. في السنوات الأخيرة ، ظهر تعدد الإرسال IHC كحل ، مما يتيح الكشف المتزامن عن مستضدات متعددة وتصورها داخل نفس عينة الأنسجة. تلعب الخلايا القاتلة الطبيعية للرحم (uNK) دورا محوريا في عمليات الحمل المبكرة ، بما في ذلك إزالة الولادة ، وإعادة تشكيل الشرايين الحلزونية الرحمية ، وزرع الأجنة. تظهر أنواع فرعية مختلفة من خلايا uNK وظائف مختلفة ، مما يسمح لها بتنسيق الأحداث البيولوجية المختلفة لنمو الجنين الناجح والحمل. لذلك ، يعد البحث المتعمق حول الأنواع الفرعية لخلايا uNK ضروريا لتوضيح آليات تنظيم المناعة أثناء الحمل. توفر هذه الدراسات رؤى قيمة ومناهج جديدة لمعالجة الحالات ذات الصلة مثل العقم والفشل الإنجابي المتكرر. تقدم هذه الورقة بروتوكول تلطيخ IHC متعدد الإرسال مفصل لدراسة كثافة أربعة أنواع فرعية من خلايا uNK في عينات بطانة الرحم أثناء نافذة الزرع (WOI). يتضمن البروتوكول إعداد العينة ، وتحسين علامات النوع الفرعي ، والتصوير المجهري ، وتحليلات البيانات. يوفر بروتوكول تلطيخ IHC متعدد الإرسال هذا خصوصية وحساسية عالية ، مما يتيح الكشف المتزامن عن أنواع فرعية مختلفة من خلايا uNK ، وبالتالي تزويد الباحثين بأداة قوية لاستكشاف تعقيدات وآليات تنظيم المناعة أثناء الحمل.

Introduction

تم الإبلاغ عن أول ولادة حية موثقة بعد الإخصاب في المختبر ونقل الأجنة (IVF-ET) في عام 1978. على مدار الأربعين عاما الماضية ، كان هناك طلب كبير على مساعدة أطفال الأنابيب بين الأزواج المصابين بالعقم¹. في عام 2021 ، بدأ 238,126 مريضا ما مجموعه 413,776 دورة أطفال الأنابيب في الولايات المتحدة. هذا يمثل زيادة بنسبة 25٪ في الدورات عن عامين سابقين وزيادة بنسبة 135٪ عن عام 2012². وتعزى هذه الزيادة بشكل أساسي إلى ارتفاع معدل انتشار العقم وتأخر التخطيط للحمل. أدت التطورات في تقنيات زراعة الأجنة وبروتوكولات الإباضة الزائدة إلى زيادة معدل المواليد الأحياء لكل دورة ET ، حيث وصلت إلى 30٪ -50٪ في النساء دون سن 40 عاما وأقل من 30٪ في النساء الأكبر من 40 عاما². ومع ذلك ، على الرغم من هذه التطورات ، لا يزال أكثر من نصف الأجنة المنقولة تفشل في الزرع. يؤثر فشل الزرع المتكرر (RIF) ، الذي يعرف عادة بأنه فشل بعد ثلاث محاولات متتالية أو أكثر لنقل أجنة عالية الجودة ، على 15٪ من النساء اللواتي يخضعن لعملية التلقيح الاصطناعي^{- ET 3}. الأزواج المصابون ب RIF معرضون للغاية للخضوع لإجراءات باهظة الثمن وغير ضرورية يمكن أن تعرضهم لمخاطر لا داعي لها⁴. لذلك ، فإن فهم أسباب RIF وتحسين زرع الأجنة أمر بالغ الأهمية لتعزيز نجاح التلقيح الاصطناعي - ET ، خاصة بالنسبة للنساء المصابات ب RIF. يعد تحضير بطانة الرحم أمرا بالغ الأهمية لنجاح زرع الجنين. تتميز هذه العملية بتراكم كبير للخلايا القاتلة الطبيعية للرحم (uNK) ، والتي تنتقل من تشكيل 30٪ من إجمالي الخلايا الليمفاوية في بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة للإفراز إلى 70٪ -80٪ في الطبقة القاتلة أثناء الحمل^{المبكر 5}. والجدير بالذكر أن خلايا uNK تختلف عن الخلايا القاتلة الطبيعية المحيطية ، وهي خلايا ليمفاوية سامة للخلايا ضرورية لجهاز المناعة الفطري للتسبب في موت الخلايا المصابة من خلال التحلل أو موت الخلايا المبرمج. في حين أن الوظائف الدقيقة لخلايا uNK ليست مفهومة تماما بعد ، تشير عدة خطوط من الأدلة إلى أنها متورطة في إعادة تشكيل تكوين الأوعية الدموية ، وغزو الأرومة الغاذية ، ونمو الجنين⁶. اكتسب الارتباط بين النسبة المئوية لخلايا uNK على الخلايا اللحمية و RIF جاذبية واسعة النطاق على مدار العشرين عاما الماضية. أظهر تحليل تلوي حديث ، شمل 8 دراسات شملت 604 امرأة ، أن كثافة خلايا CD56 + uNK خلال المرحلة الصفراء المتوسطة تزداد بشكل كبير في النساء المصابات ب RIF مقارنة بالضوابط الخصوبة⁷. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن خصائص خلايا uNK خلال المرحلة الصفرية الأصفرية تختلف اختلافا كبيرا عن خصائص خلايا الخلايا القاتلة الطبيعية (dNK). على الرغم من أن خلايا uNK قد تتمايز بشكل أكبر إلى مجموعات فرعية مختلفة من خلايا dNK بعد الحمل ، إلا أن قياس خلايا uNK وحدها لا يمثل بدقة خلايا dNK⁸. تخضع خلايا uNK للتمايز الديناميكي وتلعب أدوارا مختلفة في الدورة الشهرية وعمليات إزالة الانبعاثات ، مما يجعلها أكثر تعقيدا مما يمكن تحديده بواسطة CD56 وحده. مطلوب علامات متعددة لتحقيق فهم شامل لسلوك خلايا uNK أثناء تحضير بطانة الرحم. استخدمت دراستنا الحديثة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد تنوع خلايا uNK طوال دورات الحيض. أظهرت النتائج ، التي تم التحقق من صحتها باستخدام قياس التدفق الخلوي ، وجود أربعة أنواع فرعية متميزة من خلايا uNK ، كل منها يظهر تغيرات ديناميكية خلال الدورة الشهرية⁹. يشير تحليل التخصيب الجيني والإثراء الوظيفي لعلم الأنطولوجيا الجيني إلى أن هذه المجموعات الفرعية uNK تؤدي وظائف مختلفة في مراحل مختلفة من الحيض. ومع ذلك ، فإن قياس التدفق الخلوي لا يمكن الوصول إليه عالميا في المختبرات السريرية ، كما أن المعالجة الفورية لأنسجة بطانة الرحم الطازجة لهضم الإنزيم تجعل من المستحيل تكرار الخطوات التجريبية عند الأخطاء.

لذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في قياس هذه المجموعات الفرعية الأربعة لخلايا NK باستخدام مقايسة تلطيخ متعددة الإرسال ، والتي توفر نهجا تشخيصيا أكثر عملية. في التلوين المتعدد ، ترتبط الأجسام المضادة المحددة المختلفة ضد كل هدف بملصقات فلوروفور مختلفة تنبعث منها أطوال موجية مختلفة من الضوء عند إثارتها بطول موجي معين من الضوء. بالمقارنة مع طريقة تلطيخ IHC التقليدية ، يمكن لهذه الطريقة مقارنة الوفرة النسبية وتوزيع الأهداف المتعددة في عينة من الناحية الكمية وتوفير معلومات حول التفاعل والتوطين المشترك للأهداف المختلفة ، مما يمكننا من تحديد أنواع فرعية مختلفة من خلايا uNK. لن يؤدي هذا النهج إلى تعميق فهمنا للعلاقة بين خلايا uNK و RIF فحسب ، بل سيوفر أيضا رؤى للتحقيق في مجموعات الخلايا المناعية الفرعية الأخرى في الأمراض المرتبطة ببطانة الرحم.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث السريري العنقودي الشرقي المشتركة بين الجامعة الصينية في هونغ كونغ والأقاليم الجديدة (رقم مرجع CREC: 2022.581). تم تعيين النساء المصابات ب RIF من مركز تكنولوجيا المساعدة على الإنجاب ، مستشفى أمير ويلز ، جامعة هونغ كونغ الصينية. تم تعريف RIF على أنه الفشل في تحقيق الحمل السريري بعد نقل ما لا يقل عن 4 أجنة ذات نوعية جيدة في 3 دورات جديدة أو مجمدة على الأقل في امرأة تقل أعمارها عن 40 عاما^{و 10} سنوات. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المشاركين قبل جمع خزعات بطانة الرحم.

1. الحصول على عينات بطانة الرحم ومعالجتها

1. توقيت جمع عينات بطانة الرحم
   1. جمع عينات بطانة الرحم باتباع بروتوكول صارم لضمان الاتساق بين المشاركين في الدراسة. بالنسبة للمرضى الذين يعانون من دورات طبيعية ، قم بإجراء تحليل البول من اليوم^التاسع من الدورة الشهرية وإجراء خزعة بطانة الرحم في اليوم^السابع بعد زيادة الهرمون اللوتيني (LH + 7) ¹¹ . بالنسبة للمرضى الذين يخضعون لدورات العلاج بالهرمونات البديلة (HRT) ، قم بإعطاء 6 ملغ من استراديول فاليرات عن طريق الفم يوميا بدءا من اليوم 2 من الدورة الشهرية.
   2. تقييم سمك بطانة الرحم عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية في اليوم 13 من الدورة الشهرية. عندما يصل سمك بطانة الرحم إلى 8 مم أو يتجاوزه، يتم تطبيق هرمون البروجسترون عبر المهبل وإجراء خزعة بطانة الرحم بعد 5 أيام من إعطاء هرمون البروجسترون¹².
2. جمع عينات بطانة الرحم وتثبيتها: إدخال أخذ عينات من الماصة في تجويف الرحم ، ودفعها إلى منطقة القاع ؛ ضعي الشفط عن طريق سحب المكبس الداخلي لأسفل ، وكشط سطح بطانة الرحم في نفس الوقت من خلال الحركات الدورانية والرأسية داخل تجويف الرحم. اشطف العينات التي تم جمعها بمحلول ملحي عادي للتخلص من إفرازات عنق الرحم والرحم. قياس العينات وتقييم الحجم. للحصول على عينات 3 مم × 15-25 مم ، اغمرها على الفور في 10 مل من الفورمالين المحايد 10٪ وقم بإصلاحها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-48 ساعة.
3. الجفاف: عند الانتهاء من التثبيت ، قم بإخضاع العينات لتسلسل الجفاف المصمم لاستبدال الماء بالإيثانول. للقيام بذلك ، اغمر الأنسجة في حمامات الإيثانول بنسبة 70٪ و 80٪ و 100٪ لضمان الجفاف الكامل. بعد حمام الإيثانول النهائي ، قم بمسح العينات في الزيلين لإزالة أي كحول متبقي وإعدادها لتسلل البارافين.
4. التضمين: بعد وضع الأنسجة بشكل مسطح في قاع القالب ، قم بإذابة البارافين وإضافته بعناية إلى العينات للتأكد من أن أنسجة بطانة الرحم مغلفة بالكامل في مصفوفة البارافين. بعد ملء القوالب بشمع البارافين ، قم بتبريدها على طاولة الفريزر لتعزيز تصلب شمع البارافين. بمجرد أن تصلب كتل البارافين ، قم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى تتطلب مزيدا من المعالجة.
   ملاحظة: تم اختيار القوالب المستخدمة خصيصا لاستيعاب حجم عينات بطانة الرحم التي تم الحصول عليها للسماح لأنسجة بطانة الرحم بالاستلقاء بشكل مسطح في الأسفل دون طي ، وبالتالي ضمان الاتجاه الأمثل للتقسيم اللاحق ودون إحداث فائض غير ضروري.
5. التقسيم: للتحضير للتقسيم ، قم بتبريد كتل البارافين على حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين. قم بتقطيع العينات إلى أقسام بحجم 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم ، متبوعا بتسطيح الشرائح على سطح الماء المقطر الدافئ إلى 42 درجة مئوية وتثبيتها على شرائح زجاجية لاصقة. ضع الشرائح على مجفف منزلق طوال الليل واحفظها في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

2. تحسين ظروف الكيمياء المناعية متعددة الإرسال

1. التحقق من صحة IHC: للتحقق من صحة معلمات تلطيخ IHC ، اعتمد نهجا منهجيا لضبط الظروف لاسترجاع المستضد وتركيز الأجسام المضادة وأوقات الحضانة.
   1. ضمن نطاقات التخفيف الموصى بها من قبل الشركة المصنعة ، اختبر 2-3 تركيزات لكل جسم مضاد. تحسين استرجاع المستضد من خلال مقارنة المخازن المؤقتة عند درجة الحموضة 6 ودرجة الحموضة 9 ، وتقييم بروتوكولات الحضانة في كل من درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة وبين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بتقييم كل حالة بدقة ، مع التركيز على شدة التلوين والخصوصية وضوضاء الخلفية. حدد التركيبة المثلى التي تنتج التلطيخ الأكثر وضوحا وتحديدا مع الحد الأدنى من الربط غير المحدد. وقد ضمن هذا التحقق الصارم أعلى دقة وقابلية للتكرار في بروتوكول IHC.
2. تلطيخ أحادي تضخيم إشارة التيراميد (TSA): بعد تحديد معلمات التلوين المثلى للأجسام المضادة الفردية ، قم بتحسين إقران الأجسام المضادة بأصباغ TSA المختلفة. قم بإقران العلامة بتعبير أعلى بصبغة ذات مستوى شدة مضان أقل ، أو العكس. خلال هذه المرحلة ، قم بإجراء تعديلات على تركيز الجسم المضاد ووقت الحضانة وفقا لقوة إشارة التألق المرصودة. إذا لوحظت خلفية كبيرة أو تلطيخ غير محدد ، فقم بتغيير الصبغة المقترنة¹³.
3. تلطيخ TSA متعدد الإرسال: بالنسبة لبروتوكول الكيمياء المناعية متعددة الإرسال (m-IHC) ، تم تحديد الترتيب المتسلسل للتلوين بعناية وفقا للمبادئ المعمول بها. للتأكد من أن عملية تعدد الإرسال تعكس حساسية وخصوصية تلطيخ التسمية الواحدة ، الأجسام المضادة ذات الأولوية ذات مستويات التعبير المنخفضة في بداية تسلسل التلوين. ضع الأجسام المضادة التي تتطلب إصلاحا أساسيا لاسترجاع المستضد في نهاية تسلسل التلوين ، حيث يكون إصلاح القاعدة قويا مقارنة بالطرق القائمة على الأحماض ، والتي يمكنها ، في بعض الحالات ، تضخيم القطع الأثرية غير المحددة.
4. باستخدام النتائج المستخلصة من الخطوتين 2.1 و 2.2 ، حدد الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها وفي أي مرحلة ، بناء على متطلبات استرجاع المستضد وكثافة التعبير. على سبيل المثال ، تم وضع الجسم المضاد CXCR4 ، الذي يتطلب إصلاحا أساسيا لاسترجاع المستضد ، في المراحل النهائية من التلوين. على العكس من ذلك ، تم إعطاء الجسم المضاد CD49a ، الذي يتميز بكثافة أقل من التعبير ، الموضع الأول في تسلسل التلوين. قم بزيادة فرص الكشف الناجح وتقليل أي تأثيرات إخفاء قد تحدث في المراحل اللاحقة من إجراء تعدد الإرسال.
5. بالنسبة للأجسام المضادة المتبقية ، اختبر مجموعات مختلفة خلال مرحلة التحسين لتحديد التسلسل الأكثر فعالية الذي يوازن بين الحساسية والخصوصية. ستوجه نتائج هذه التحليلات المقارنة التكوين النهائي للوحة تعدد الإرسال ، كما هو مفصل في الجدول 1 ، مما يضمن أن اللوحة المختارة توفر الأداء الأمثل مع تقليل الخلفية إلى الحد الأدنى.

3. عملية M-IHC

1. إزالة الشمع والترطيب والتثبيت: اخبز أقسام الأنسجة على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين ، متبوعا بالغمر المتسلسل في الزيلين الأول (10 دقائق) ، الزيلين الثاني (10 دقائق) ، 100٪ إيثانول (5 دقائق) ، 95٪ إيثانول (5 دقائق) ، 80٪ إيثانول (5 دقائق) ، 75٪ إيثانول (5 دقائق) ، ddH₂O (دقيقتان لمدة 3 أضعاف) ، 10٪ فورمالين محايد مخزن (20 دقيقة على الأقل) ، و ddH₂O (دقيقتان لمدة 3x).
2. استرجاع المستضد: أضف 200 مل من المخزن المؤقت AR6 أو AR9 المعني ، كما هو موضح في الجدول 1 لكل جسم مضاد ، إلى كاسيت استرجاع مستضد مقاوم للحرارة. ضع الأقسام في المخزن المؤقت المناسب لاسترجاع المستضد وقم بتسخينها في الميكروويف على طاقة عالية لمدة دقيقتين تقريبا حتى الغليان. بعد ذلك ، قم بتغطية الكاسيت بشكل غير محكم ، وقم بتسخينه على طاقة منخفضة لمدة 15 دقيقة ، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. اشطف الأقسام باستخدام ddH₂O و PBST.
3. رسم حاجز مسعور: بعد إزالة المحلول الزائد بورق ماص ، ارسم دائرة كاملة حول الأنسجة باستخدام قلم حاجز كاره للماء.
4. تعطيل نشاط الإنزيم الداخلي: عالج الأقسام التي تحتوي على 3٪ بيروكسيد الهيدروجين واحتضانها لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل باستخدام PBST 3x لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
5. حجب المواقع غير المحددة: بعد التجفيف بورق ماص ، ضع محلول مانع (1x مخفف / كتلة للأجسام المضادة) واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. الحضانة بالجسم المضاد الأولي: بعد إزالة محلول الحجب ، ضع 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي الأول ، CD49a ، على كل شريحة بتخفيف 1: 1000 في 1x مخفف للأجسام المضادة. احتضان كما تم تحسينه مسبقا في القسم 2. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح باستخدام PBST 3x لمدة دقيقتين لكل منها. بالنسبة للأجسام المضادة المتبقية ، انظر الجدول 1 لمعرفة نسب التخفيف المحددة.
7. الحضانة بالجسم المضاد الثانوي: قبل تطبيق الجسم المضاد الثانوي ، استخدم ورقا ماصا لإزالة الرطوبة الزائدة لمنع تخفيف الكاشف. أضف 4-5 قطرات (حوالي 150 ميكرولتر) من الجسم المضاد الثانوي 1x Anti-Ms + Rb HRP على كل شريحة ، متبوعا بحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام PBST لمدة 2 دقيقة لكل فترة بعد الحضانة.
   ملاحظة: يرجى ملاحظة أن الجسم المضاد الثانوي 1x Anti-Ms + Rb HRP خاص بالأجسام المضادة الأولية للأرانب والفأر.
8. تضخيم الإشارة بصبغة TSA: بعد نشاف الرطوبة الزائدة ، قم بتخفيف صبغة TSA 1: 100 في مخفف التضخيم. أضف 150 ميكرولتر من محلول صبغة TSA المخفف إلى كل شريحة. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل باستخدام PBST 3x لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
9. كرر الخطوتين 3.2 و 3.5-3.8 لإجراء TSA باستخدام الجسم المضاد والصبغة المقابلين.
10. نوى التلوين: بعد تلطيخ الجسم المضاد الأخير ، تخلص من الفلوروفورات غير المنضمة عن طريق وضع أقسام في الميكروويف في 200 مل من المخزن المؤقت AR6 داخل كاسيت مقاوم للحرارة ، ثم الغليان لمدة دقيقتين ، ثم تسخين منخفض الطاقة لمدة 15 دقيقة. تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة واشطفها باستخدام ddH₂O و PBST. أضف 150 ميكرولتر من محلول عمل DAPI المخفف في PBST (1:10) بالتنقيط ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واشطفه 2x باستخدام ddH₂O.
11. التركيب: بمجرد تجفيف الأقسام بالهواء بالكامل في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة تقريبا ، ضع قطرة واحدة (حوالي 30 ميكرولتر) من حامل الفلورسنت المضاد للتبريد ، وضع أغطية.
    ملاحظة: حماية جميع العمليات من الضوء بعد التطبيق الأول لصبغة TSA. كانت المراقبة السريعة والتقاط الصور ضروريين بعد الانتهاء من التلوين لمنع التبريد الفلوري.

4. الحصول على الصور وتحليلها

1. وقت التعرض: التقط الصور باستخدام جهاز تصوير يرث الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث المقابلة للفلوروفورات. عند تعيين أوقات التعريض الضوئي، تحقق من الشرائح التي تحتوي على مجموعة كبيرة من تعبيرات العلامات لضمان الدقة. لكل مجموعة علامة/مرشح، ركز يدويا على مناطق مختلفة من الشريحة. استخدم ميزة التعريض الضوئي التلقائي لضبط وقت التعريض الضوئي.
2. حدد المرشحات وفقا لأصباغ TSA ، وافحص شرائح متعددة لتحديد أوقات التعرض المثلى لكل قناة. قم بتطبيق هذه الإعدادات بشكل متسق على جميع عمليات الاقتناء اللاحقة للحفاظ على قابلية المقارنة طوال التصوير.
3. اختيار مناطق الالتقاط: لضمان أخذ عينات غير متحيزة عبر أقسام الأنسجة وإدراج متسق للظهارة اللمعية في كل حقل تم تحليله ، حدد بشكل عشوائي المنطقة الأولية للحصول على الصورة ، مع وجود المعيار الحاسم هو وجود الحدود الظهارية اللمعية.
4. بعد التقاط هذا الحقل الأولي ، حدد المناطق اللاحقة بشكل منهجي عن طريق تحريك حقل واحد إلى يسار أو يمين نقطة البداية (حذف حقل واحد بين كل صورة تم التقاطها) مع الحفاظ على الحدود الظهارية اللمعية داخل الإطار. كرر هذه العملية لالتقاط خمس مناطق مختلفة على الأقل ، تحتوي كل منها على جزء على الأقل من الظهارة اللمعية ، للحفاظ على عمق ثابت للتحليل طوال¹⁴. يهدف هذا النهج إلى تضمين ما لا يقل عن 10,000 خلية لحمية في جميع الحقول التي تم التقاطها لضمان جمع البيانات الشاملة والتمثيلية.
5. تحليل الصور
   1. إعداد الصورة: لاستيراد الصور متعددة الأطياف وتحليلها، انتقل أولا إلى ملف > فتح الصورة في واجهة البرنامج لتحميل الملفات وشريحة التألق الذاتي (AF). بعد تحميل الصور ، تابع فك خلط الفلوروفورات بالنقر فوق حدد الفلور زر وتحديد المكتبة الطيفية المناسبة. بمجرد تحديد جميع الفلوروفورات ، انقر فوق موافق لتأكيد التحديد. لعزل طيف التركيز البؤري التلقائي، استخدم أداة قطارة التركيز البؤري التلقائي لأخذ عينات من منطقة تمثيلية من الأنسجة من صورة التركيز البؤري التلقائي، مع الحرص على استبعاد أي وحدات بكسل غير نسيجية. بعد أخذ العينات ، انقر فوق إعداد الصورة أو إعداد الكل في الزاوية اليسرى السفلية من الواجهة¹⁵.
   2. تجزئة الأنسجة: ابدأ عملية التجزئة عن طريق تحديد خط أساس يدويا من 3-5 مناطق لكل نوع من الأنسجة داخل الصورة ، بما في ذلك المناطق الظهارية التي تحتوي على الخلايا الظهارية ، والمناطق اللحمية التي تحتوي على الخلايا اللحمية ، والمناطق الفارغة التي لا تحتوي على محتوى خلوي. إذا كانت نتائج التجزئة الأولية غير مرضية ، فقم بالتعليق يدويا على مناطق إضافية لتحسين مجموعة بيانات التدريب ، وبالتالي زيادة دقة وموثوقية التحليلات اللاحقة. يضمن هذا الضبط الديناميكي للمناطق والمعلمات أن البرنامج يمكنه تحديد الهياكل المتشابهة تلقائيا في الصور الحالية وغيرها من الصور المستوردة بدقة متزايدة.
      ملاحظة: يعمل التعليق التوضيحي الأولي كمجموعة بيانات تدريبية للبرنامج لمعرفة خصائص كل مكون من مكونات الأنسجة. ثم يتم تحسين قدرات تجزئة البرنامج بشكل متكرر بناء على تعقيد الأنسجة وتنوعها.
   3. تجزئة الخلايا: انقر فوق تجزئة الخلايا لبدء تجزئة الخلايا. في إعداد تجزئة الخلايا، حدد النوى والغشاء. اختر DAPI لتحديد نوى الخلية وضبط إعداد الشدة لاكتشاف جميع نوى الخلية بدون ضوضاء في الخلفية. حدد إشارات CD16 و CD49a و CD56 للعثور على الغشاء واستخدم هذه الإشارة للمساعدة في الانقسام النووي. استخدم ميزة تقسيم المكونات النووية لتمييز النوى الموجودة عن كثب.
      ملاحظة: يسلط DAPI الضوء على الجزء الداخلي من الخلايا. تساعد ميزة تقسيم المكونات النووية على تمييز نوى الخلية عندما تكون قريبة من بعضها البعض أو تبدو مدمجة. هذه الخطوة مهمة للحصول على عدد خلايا موثوق به والحفاظ على سلامة التحليل.
   4. التنميط الظاهري للخلية: اعتماد أربع علامات مختلفة لسطح الخلية بما في ذلك CD56 و CD49a و CXCR4 و CD16 للتمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا القاتلة الطبيعية. في مخطط التنميط الظاهري ، قم بتسمية هذه العلامات الأربع على أنها الأنماط الظاهرية للمضي قدما. في المقطع إقران طريقة العرض، قم بتعيين ألوان محددة لكل نمط من الأنماط الظاهرية للتحديد. باستخدام الزر "إضافة" ، قم بتصنيف الخلايا على أنها تعبر بشكل إيجابي أو سلبي عن العلامات ؛ على سبيل المثال ، في النمط الظاهري CD56 ، يمكن تسمية الخلايا على أنها CD56 + أو CD56-. قم بتسمية خمس خلايا على الأقل يدويا لكل نمط ظاهري أثناء عملية التدريب. قم بإجراء وضع العلامات اليدوية الإضافية إذا لم يسفر التدريب الأولي عن نتائج فعالة.
   5. بعد تعيين تكوين التنميط الظاهري للخلية، ستشير كل خلية في الصورة إلى ما إذا كانت علامات السطح الأربعة يتم التعبير عنها بشكل إيجابي أو سلبي. تصدير البيانات الناتجة إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
   6. معالجة البيانات: استيراد البيانات التي تم الحصول عليها من جميع الصور إلى جدول بيانات للمعالجة. احسب النسب المئوية لجميع الأنواع الفرعية لخلايا uNK بالنسبة إلى إجمالي عدد الخلايا في الصورة. يمثل عدد الخلايا النهائي متوسط العدد عبر صور متعددة ، مما يوفر نظرة عامة شاملة على مجموعة الأنواع الفرعية المختلفة لخلايا uNK داخل العينة.

النتائج

للحفاظ على الاتساق في توقيت جمع عينات بطانة الرحم للنساء اللواتي يخضعن للدورة الطبيعية ، تم إجراء اختبار بول للكشف بدقة عن زيادة الهرمون اللوتيني (LH) ، مع إجراء خزعات بطانة الرحم بعد 7 أيام من زيادة الهرمون اللوتيني (LH). بالنسبة للنساء اللواتي يخضعن لدورات العلاج التعويضي...

Discussion

ينطوي زرع الجنين على تفاعل معقد بين الجنين وبطانة الرحم. تلعب الحالة المناعية لتوازن بطانة الرحم دورا محوريا في تحديد تقبل بطانة الرحم. خلال WOI ، تكون مجموعة الكريات البيض السائدة في بطانة الرحم هي الخلايا القاتلة الطبيعية. ما يقرب من 90٪ من خلايا uNK تظهر تعبيرا عاليا عن CD56...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining