使用多重荧光免疫组织化学染色测量反复植入失败女性的四种子宫 NK 细胞亚型

摘要

本研究提出了一种开创性的方法，使用先进的多重荧光免疫组织化学染色技术在植入窗口期间量化子宫自然杀伤细胞亚群。

摘要

免疫组织化学 （IHC） 在生物学研究和临床诊断中起着至关重要的作用，是识别和可视化组织抗原的最常用方法。然而，传统的 IHC 染色方法在区分免疫细胞的各种亚型方面存在局限性。这一挑战促使科学家探索新技术和方法，以精确识别和区分免疫细胞亚型。近年来，多重 IHC 已成为一种解决方案，能够在同一组织样本中同时检测多种抗原并对其进行可视化。子宫自然杀伤 （uNK） 细胞在怀孕早期过程中起着关键作用，包括蜕膜化、子宫螺旋动脉重塑和胚胎植入。uNK 细胞的不同亚型表现出不同的功能，使它们能够协调各种生物事件，以实现成功的胚胎发育和怀孕。因此，对 uNK 细胞亚型的深入研究对于阐明妊娠期免疫调节机制至关重要。此类研究为解决不孕症和复发性生殖衰竭等相关疾病提供了有价值的见解和新方法。本文介绍了一种详细的多重 IHC 染色方案，用于研究植入窗口 （WOI） 期间子宫内膜标本中四种亚型 uNK 细胞的密度。该方案包括样品制备、亚型标记物优化、显微成像和数据分析。这种多重 IHC 染色方案具有高度特异性和灵敏度，能够同时检测不同的 uNK 细胞亚型，从而为研究人员提供了探索妊娠期间免疫调节的复杂性和机制的有力工具。

引言

1978 年报道了 体外 受精-胚胎移植 （IVF-ET） 后首次记录的活产。在过去的 40 年里，不孕夫妇对 IVF-ET 的帮助需求很高¹。2021 年，美国有 238,126 名患者共启动了 413,776 个 IVF 周期。这标志着周期数比 2 年前增加了 25%，比 2012 年增加了 135%²。这种激增主要归因于不孕症患病率的上升和怀孕计划的延迟。胚胎培养技术和超排卵方案的进步导致每个 ET 周期的活产率增加，40 岁以下女性达到 30%-50%，40 岁以上女性低于 30%²。然而，尽管取得了这些进步，但超过一半的移植胚胎仍然无法植入。重复植入失败 （RIF），通常定义为连续三次或更多次尝试移植高质量胚胎后失败，影响了 15% 的接受 IVF-ET³ 的女性。患有 RIF 的夫妇非常脆弱，更容易接受昂贵且不必要的程序，这可能会使他们面临不必要的风险⁴。因此，了解 RIF 的原因并改善胚胎植入对于提高 IVF-ET 的成功率至关重要，尤其是对于患有 RIF 的女性。子宫内膜的准备对于胚胎成功植入至关重要。这个过程的特点是子宫自然杀伤 （uNK） 细胞的显着积累，这些细胞从分泌中期子宫内膜中占总淋巴细胞的 30% 转变为怀孕早期蜕膜中 70%-80%⁵。值得注意的是，uNK 细胞与外周 NK 细胞不同，外周 NK 细胞是细胞毒性淋巴细胞，对先天免疫系统至关重要，可通过裂解或凋亡导致感染细胞死亡。虽然 uNK 细胞的确切功能尚不完全清楚，但几条证据表明它们参与血管生成重塑、滋养层浸润和胎儿发育⁶。在过去 20 年中，uNK 细胞与基质细胞的百分比与 RIF 之间的关联已获得广泛的吸引力。最近的一项荟萃分析包括 8 项研究，涉及 604 名女性，结果表明，与可生育对照相比，RIF 女性在黄体中期的 CD56+uNK 细胞密度显著增加⁷。然而，重要的是要注意，黄体中期 uNK 细胞的特征与蜕膜 NK （dNK） 细胞的特征显着不同。尽管 uNK 细胞可能在怀孕后进一步分化成 dNK 细胞的各种亚群，但单独测量 uNK 细胞并不能准确代表 dNK 细胞⁸。uNK 细胞经历动态分化，在月经周期和蜕膜化过程中发挥不同的作用，使其比单独使用 CD56 识别更复杂。在子宫内膜制备过程中，需要多个标记物才能全面了解 uNK 细胞的行为。我们最近的研究采用单细胞 RNA 测序来识别整个月经周期中 uNK 细胞的多样性。使用流式细胞术验证的结果显示，存在四种不同的 uNK 细胞亚型，每种亚型在月经周期中都表现出动态变化⁹。基因富集分析和基因本体功能富集表明这些 uNK 亚群在月经的不同阶段实现不同的功能。然而，流式细胞术在临床实验室中并不普遍可用，并且立即处理新鲜子宫内膜组织进行酶消化，这使得出错时无法重复实验步骤。

因此，本研究的目的是使用多重染色测定法研究这四个 NK 细胞亚群的测量，这提供了一种更实用的诊断方法。在多重染色中，针对每个靶标的不同特异性抗体与不同的荧光团标记相关联，当被特定波长的光激发时，这些标记会发出不同波长的光。与传统的 IHC 染色方法相比，该方法可以定量比较样品中多个靶标的相对丰度和分布，并提供有关不同靶标相互作用和共定位的信息，使我们能够识别 uNK 细胞的不同亚型。这种方法不仅会加深我们对 uNK 细胞和 RIF 之间关系的理解，而且还将为研究子宫内膜相关疾病中的其他免疫细胞亚群提供见解。

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研究方案

该研究获得香港中文大学-新界东联合联网临床研究伦理委员会（CREC ref no.: 2022.581）的批准。患有 RIF 的女性是从香港中文大学威尔斯亲王医院辅助生殖技术中心招募的。RIF 被定义为 40 岁以下女性在至少 3 个新鲜或冷冻周期中移植至少 4 个优质胚胎后未能实现临床妊娠¹⁰。在收集子宫内膜活检之前获得参与者的知情同意。

1. 子宫内膜样本的采集和处理

1. 子宫内膜标本采集的时间
   1. 按照严格的方案收集子宫内膜样本，以确保研究参与者之间的一致性。对于自然周期的患者，从月经周期的^第 9 天开始进行尿液分析，并在 LH 激增后的^第 7 天 （LH+7） 进行子宫内膜活检 （LH+7）¹¹ 。对于接受激素替代疗法 （HRT） 周期的患者，从月经周期的第 2 天开始，每天口服 6 mg 戊酸雌二醇。
   2. 在月经周期的第 13 天通过超声检查评估子宫内膜厚度。当子宫内膜厚度达到或超过 8 毫米时，经阴道施用黄体酮，并在黄体酮给药后 5 天进行子宫内膜活检¹²。
2. 子宫内膜样本采集和固定:将移液器采样器引入子宫腔，将其推进到宫底区域;通过拉下内部柱塞进行抽吸，同时通过子宫腔内的旋转和垂直运动刮擦子宫内膜表面。用生理盐水冲洗采集的标本，以消除宫颈和子宫分泌物。测量样品并评估大小。对于 3 mm x 15-25 mm 样品，立即将其浸入 10 mL 10% 中性缓冲福尔马林中，并在室温下固定 24-48 小时。
3. 脱水:固定完成后，对样品进行脱水序列，旨在用乙醇代替水。为此，将组织浸入 70%、80%、90% 和 100% 乙醇浴中，以确保完全脱水。在最后一次乙醇浴之后，用二甲苯澄清样品以去除任何残留的酒精，并准备用于石蜡浸润。
4. 包埋:将组织平放在模具底部后，熔化石蜡并小心地将其添加到样品中，以确保子宫内膜组织完全封装在石蜡基质中。用石蜡填充模具后，将它们放在冷冻台上冷却，以促进石蜡凝固。石蜡块硬化后，在室温下储存，直到需要进一步加工。
   注意:所使用的模具是专门选择的，以适应所获得的子宫内膜样本的大小，以使子宫内膜组织平放在底部而不会折叠，从而确保后续切片的最佳方向，而不会产生不必要的过量。
5. 切片:为了准备切片，将石蜡块在 4 °C 下冷藏 2 小时。使用切片机将样品切成 4 μm 切片，然后在加热至 42 °C 的蒸馏水表面上将切片压平并将它们安装在粘性载玻片上。将切片放在载玻片干燥机上过夜，并在使用前在室温下储存。

2. 多重免疫组织化学条件的优化

1. IHC 验证:为了验证 IHC 染色参数，采用系统方法来微调抗原修复、抗体浓度和孵育时间的条件。
   1. 在制造商建议的稀释范围内，测试每种抗体的 2-3 浓度。通过比较 pH 6 和 pH 9 下的缓冲液来优化抗原修复，并评估在室温下孵育 1.5 小时和 4 °C 过夜的孵育方案。
   2. 仔细评估每种情况，重点关注染色强度、特异性和背景噪音。选择最佳组合，产生最清晰、最特异性的染色，同时具有最小的非特异性结合。这种严格的验证确保了 IHC 方案中最高的准确性和可重复性。
2. 酪胺信号放大 （TSA） 单链染色:在确定单个抗体的最佳染色参数后，优化抗体与不同 TSA 染料的配对。将表达量较高的标记物与荧光强度水平较低的染料配对，反之亦然。在此阶段，根据观察到的荧光信号强度调整抗体浓度和孵育时间。如果观察到明显的背景染色或非特异性染色，则更改配对染料¹³。
3. TSA 多重染色:对于多重免疫组织化学 （m-IHC） 方案，已根据既定原则仔细定义了染色的顺序。为了确保多重检测过程反映单标记染色的灵敏度和特异性，在染色序列开始时优先考虑表达水平较低的抗体。将需要碱基修复以进行抗原修复的抗体放在染色序列的末尾，因为与基于酸的方法相比，碱基修复是稳健的，在某些情况下，酸基修复会放大非特异性染色伪影。
4. 使用步骤 2.1 和 2.2 的结果，根据抗体的抗原修复要求和表达密度决定要使用的抗体以及在哪个阶段使用。例如，需要碱基修复才能进行抗原修复的 CXCR4 抗体已进入染色的最后阶段。相反，CD49a 抗体的特征是表达密度较低，在染色序列中被赋予了第一个位置。最大限度地提高成功检测的机会，并最大限度地减少在多重检测程序的后期可能发生的任何掩蔽效应。
5. 对于其余抗体，在优化阶段测试不同的组合，以确定平衡敏感性和特异性的最有效序列。这些比较分析的结果将指导多重检测组合的最终组成，如 表 1 所示，确保所选检测组合提供最佳性能，同时最大限度地减少背景。

3. m-IHC 工艺

1. 脱蜡、水合和固定:将组织切片在 60 °C 下烘烤 2 小时，然后依次浸入二甲苯 I（10 分钟）、二甲苯 II（10 分钟）、100% 乙醇（5 分钟）、100% 乙醇（5 分钟）、95% 乙醇（5 分钟）、80% 乙醇（5 分钟）、75% 乙醇（5 分钟）、ddH₂O（2 分钟，3 次）、10% 中性缓冲福尔马林（至少 20 分钟）， 和 ddH₂O（3 倍 2 分钟）。
2. 抗原修复:将 200 mL 相应的 AR6 或 AR9 缓冲液（如 表 1 中每种抗体所列）添加到耐热抗原修复盒中。将切片放入适当的抗原修复缓冲液中，并在微波炉中以高功率加热约 2 分钟直至沸腾。随后，松散地盖上盒，以小功率加热 15 分钟，然后冷却至室温。用 ddH₂O 和 PBST 冲洗切片。
3. 绘制疏水屏障:用吸水纸去除多余的溶液后，使用疏水屏障笔在组织周围画一个完整的圆圈。
4. 内源性酶活性的灭活:用 3% 过氧化氢处理切片，并在室温下孵育 8 分钟。用 PBST 洗涤 3 次，每次 2 分钟。
5. 封闭非特异性位点:用吸水纸干燥后，涂上封闭液（1x 抗体稀释剂/封闭剂）并在室温下孵育 10 分钟。
6. 与一抗孵育:去除封闭液后，将 150 μL 第一一抗 CD49a 以 1:1000 的稀释度溶于 1x 抗体稀释液中，涂于每张玻片上。按照之前在第 2 节中优化的方式孵育。孵育后，用 PBST 洗涤载玻片 3 次，每次 2 分钟。对于其余抗体，具体稀释比例见 表 1 。
7. 与二抗孵育:在使用二抗之前，使用吸水纸去除多余的水分，以防止试剂稀释。在每张载玻片上加入 4-5 滴（约 150 μL）1x 抗 Ms + Rb HRP 二抗，然后在室温下孵育 10 分钟。孵育后用 PBST 洗涤 3 次，每次 2 分钟。
   注:请注意，1x 抗 Ms + Rb HRP 二抗对兔和小鼠一抗具有特异性。
8. 使用 TSA 染料进行信号放大:吸干多余的水分后，在放大稀释剂中以 1:100 的比例稀释 TSA 染料。向每张载玻片中加入 150 μL 这种稀释的 TSA 染料溶液。在室温下孵育 10 分钟。用 PBST 洗涤 3 次，每次 2 分钟。
9. 使用相应的抗体和染料对 TSA 程序重复步骤 3.2 和 3.5-3.8。
10. 细胞核染色:对最后一种抗体进行染色后，在耐热盒内的 200 mL AR6 缓冲液中用微波加热切片，煮沸 2 分钟，然后低功率加热 15 分钟，以去除未结合的荧光团。将样品冷却至室温，然后用 ddH₂O 和 PBST 冲洗。滴加 150 μL 用 PBST （1:10） 稀释的 DAPI 工作溶液，在室温下孵育 10 分钟，然后用 ddH₂O 冲洗 2 次。
11. 封片:切片在黑暗区域完全风干约 30 分钟后，滴入一滴（约 30 μL）抗淬灭荧光封固剂，并放置盖玻片。
    注意:首次使用 TSA 染料后，请避光处理所有操作。及时观察和图像捕获是染色后完成以防止荧光淬灭的必要条件。

4. 图像采集和分析

1. 曝光时间:使用继承与荧光基团相对应的激发和发射波长的成像仪捕获图像。设置曝光时间时，请检查具有各种标记表达式的幻灯片，以确保准确性。对于每个标记/过滤器组合，手动聚焦在幻灯片的不同区域。使用 Auto Exposure 功能设置曝光时间。
2. 根据 TSA 染料选择滤光片，并检查多个玻片以确定每个通道的最佳曝光时间。将这些设置一致地应用于所有后续采集，以保持整个成像过程中的可比性。
3. 捕获区域的选择:为确保跨组织切片的无偏采样并在每个分析区域中一致地包含管腔上皮，随机选择用于图像采集的初始区域，关键标准是管腔上皮边界的存在。
4. 在捕获此初始视野之后，通过将一个视野移动到起点的左侧或右侧（在捕获的每个图像之间省略一个视野）来系统地选择后续区域，同时保持帧内的管腔上皮边界。重复此过程以捕获至少五个不同的区域，每个区域至少包含一部分管腔上皮，以在整个¹⁴ 中保持一致的分析深度。这种方法旨在包括所有捕获区域中至少约 10,000 个基质细胞，以确保全面和具有代表性的数据收集。
5. 图像分析
   1. 图像制备:要导入和分析多光谱图像，首先导航到软件界面中的 文件>打开图像 以加载文件和自发荧光 （AF） 玻片。上传图像后，单击 Select Fluors 按钮并选择适当的光谱库，继续解混荧光团。选择所有荧光基团后，单击 OK 确认选择。要隔离 AF 光谱，请使用 AF 吸管工具从 AF 图像中对具有代表性的组织区域进行采样，注意排除任何非组织像素。采样后点击 准备图像 or 准备全部 在界面的左下角¹⁵.
   2. 组织分割:通过手动划定图像中每种组织类型 3-5 个区域的基线来启动分割过程，包括包含上皮细胞的上皮区域、包含基质细胞的基质区域和没有细胞内容的空白区域。如果初始分割结果不令人满意，请手动注释其他区域以改进训练数据集，从而提高后续分析的准确性和可靠性。这种区域和参数的动态调整确保软件能够自动识别当前和其他导入图像中的相似结构，并且精度更高。
      注意:初始注释用作软件的训练数据集，以学习每个组织成分的特性。然后，根据组织的复杂性和可变性迭代优化软件的分割功能。
   3. 单元格分割:单击 Segment Cells 以开始单元格分割。在 Cell Segmentation Setting （细胞分割设置） 中，选择 Nuclei and Membrane （细胞核和膜）。 选择 DAPI 以识别细胞核并调整强度设置以检测所有细胞核，而不会产生背景噪声。选择 CD16、 CD49a 和 CD56 信号以找到膜，并利用该信号协助细胞核分裂。使用 核成分分裂 功能来区分位置紧密的细胞核。
      注意:DAPI 突出显示单元格内部。核成分分裂功能有助于区分细胞核何时靠得很近或看起来合并。此步骤对于获得可靠的细胞计数和保持分析的完整性非常重要。
   4. 细胞表型分析:采用 CD56、CD49a、CXCR4 和 CD16 四种不同的细胞表面标志物来区分 NK 细胞的不同亚型。在表型方案中，将这四个标记标记为要进行的表型。在 Associate View 部分中，为每个表型分配特定颜色以进行鉴定。使用 Add 按钮，将单元格分类为阳性或阴性表达标记物;例如，在 CD56 表型中，细胞可以标记为 CD56+ 或 CD56-。在训练过程中，为每个表型手动标记至少 5 个细胞。如果初始训练未产生有效结果，请执行额外的手动标记。
   5. 设置细胞表型配置后，图像中的每个细胞将指示四个表面标记物是阳性表达还是阴性表达。将结果数据导出到电子表格以供进一步分析。
   6. 数据处理:将从所有图像获取的数据导入到电子表格中进行处理。计算所有 uNK 细胞亚型相对于图像中细胞总数的百分比。最终细胞计数代表多个图像的平均计数，提供了样品中各种 uNK 细胞亚型种群的全面概述。

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结果

为了保持自然周期女性子宫内膜样本采集时间的一致性，进行了尿液检查以精确检测她们的黄体生成素 （LH） 激增，并在 LH 激增后 7 天进行子宫内膜活检。对于接受 HRT 周期的女性，样本安排在黄体酮补充开始后 5 天。为了量化子宫内膜中 NK 细胞的不同亚型，采用了 m-IHC 染色。实验程序的示意图概述如图 1 所示。

优化实验程?...

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讨论

胚胎植入涉及胚胎和子宫内膜之间的复杂相互作用。子宫内膜稳态的免疫状态在决定子宫内膜容受性方面起着关键作用。在 WOI 期间，子宫内膜中的主要白细胞群是 NK 细胞。大约 90% 的 uNK 细胞表现出高 CD56 表达但缺乏 CD16。然而，一小部分 uNK 细胞类似于外周血 NK 细胞，CD56 表达低，但 CD16 表达阳性¹⁸。这两种 uNK 细胞亚型表现出不同的功能。CD56+CD16- 亚?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining