使用多重荧光免疫组织化学染色测量反复植入失败女性的四种子宫 NK 细胞亚型

摘要

本研究提出了一种开创性的方法，使用先进的多重荧光免疫组织化学染色技术在植入窗口期间量化子宫自然杀伤细胞亚群。

摘要

免疫组织化学 （IHC） 在生物学研究和临床诊断中起着至关重要的作用，是识别和可视化组织抗原的最常用方法。然而，传统的 IHC 染色方法在区分免疫细胞的各种亚型方面存在局限性。这一挑战促使科学家探索新技术和方法，以精确识别和区分免疫细胞亚型。近年来，多重 IHC 已成为一种解决方案，能够在同一组织样本中同时检测多种抗原并对其进行可视化。子宫自然杀伤 （uNK） 细胞在怀孕早期过程中起着关键作用，包括蜕膜化、子宫螺旋动脉重塑和胚胎植入。uNK 细胞的不同亚型表现出不同的功能，使它们能够协调各种生物事件，以实现成功的胚胎发育和怀孕。因此，对 uNK 细胞亚型的深入研究对于阐明妊娠期免疫调节机制至关重要。此类研究为解决不孕症和复发性生殖衰竭等相关疾病提供了有价值的见解和新方法。本文介绍了一种详细的多重 IHC 染色方案，用于研究植入窗口 （WOI） 期间子宫内膜标本中四种亚型 uNK 细胞的密度。该方案包括样品制备、亚型标记物优化、显微成像和数据分析。这种多重 IHC 染色方案具有高度特异性和灵敏度，能够同时检测不同的 uNK 细胞亚型，从而为研究人员提供了探索妊娠期间免疫调节的复杂性和机制的有力工具。

引言

1978 年报道了 体外 受精-胚胎移植 （IVF-ET） 后首次记录的活产。在过去的 40 年里，不孕夫妇对 IVF-ET 的帮助需求很高¹。2021 年，美国有 238,126 名患者共启动了 413,776 个 IVF 周期。这标志着周期数比 2 年前增加了 25%，比 2012 年增加了 135%²。这种激增主要归因于不孕症患病率的上升和怀孕计划的延迟。胚胎培养技术和超排卵方案的进步导致每个 ET 周期的活产率增加，40 岁以下女性达到 30%-50%，40 岁以上女性低于 30%²。然而，尽管取得了这些进步，但超过一半的移植胚胎仍然无法植入。重复植入失败 （RIF），通常定义为连续三次或更多次尝试移植高质量胚胎后失败，影响了 15% 的接受 IVF-ET³ 的女性。患有 RIF 的夫妇非常脆弱，更容易接受昂贵且不必要的程序，这可能会使他们面临不必要的风险⁴。因此，了解 RIF 的原因并改善胚胎植入对于提高 IVF-ET 的成功率至关重要，尤其是对于患有 RIF 的女性。子宫内膜的准备对于胚胎成功植入至关重要。这个过程的特点是子宫自然杀伤 （uNK） 细胞的显着积累，这些细胞从分泌中期子宫内膜中占总淋巴....

研究方案

该研究获得香港中文大学-新界东联合联网临床研究伦理委员会（CREC ref no.： 2022.581）的批准。患有 RIF 的女性是从香港中文大学威尔斯亲王医院辅助生殖技术中心招募的。RIF 被定义为 40 岁以下女性在至少 3 个新鲜或冷冻周期中移植至少 4 个优质胚胎后未能实现临床妊娠¹⁰。在收集子宫内膜活检之前获得参与者的知情同意。

1. 子宫内膜样本的采集和处理

1. 子宫内膜标本采集的时间
   1. 按照严格的方案收集子宫内膜样本，以确保研究参与者之间的一致性。对于自然周期的患者，从月经周期的^第 9 天开始进行尿液分析，并在 LH 激增后的^第 7 天 （LH+7） 进行子宫内膜活检 （LH+7）¹¹ 。对于接受激素替代疗法 （HRT） 周期的患者，从月经周期的第 2 天开始，每天口服 6 mg 戊酸雌二醇。
   2. 在月经周期的第 13 天通过超声检查评估子宫内膜厚度。当子宫内膜厚度达到或超过 8 毫米时，经阴道施用黄体酮，并在黄体酮给药后 5 天进行子宫内膜活检¹²。
2. 子宫内膜样本采集和固定：将移液器采....

讨论

胚胎植入涉及胚胎和子宫内膜之间的复杂相互作用。子宫内膜稳态的免疫状态在决定子宫内膜容受性方面起着关键作用。在 WOI 期间，子宫内膜中的主要白细胞群是 NK 细胞。大约 90% 的 uNK 细胞表现出高 CD56 表达但缺乏 CD16。然而，一小部分 uNK 细胞类似于外周血 NK 细胞，CD56 表达低，但 CD16 表达阳性¹⁸。这两种 uNK 细胞亚型表现出不同的功能。CD56+CD16- 亚?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining