Medição de quatro subtipos de células NK uterinas usando coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada em mulheres com falha repetida de implantação

Resumo

Este estudo apresenta um método pioneiro para quantificar subconjuntos de células assassinas naturais uterinas durante a janela de implantação usando técnicas avançadas de coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada.

Resumo

A imuno-histoquímica (IHQ) desempenha um papel crucial na pesquisa biológica e no diagnóstico clínico, servindo como o método mais comumente usado para identificar e visualizar antígenos teciduais. No entanto, os métodos tradicionais de coloração IHC têm limitações na distinção de vários subtipos de células imunes. Esse desafio levou os cientistas a explorar novas tecnologias e metodologias para identificação e diferenciação precisas de subtipos de células imunes. Nos últimos anos, a IHQ multiplex surgiu como uma solução, permitindo a detecção simultânea de múltiplos antígenos e sua visualização dentro da mesma amostra de tecido. As células uterinas natural killer (uNK) desempenham um papel fundamental nos processos iniciais da gravidez, incluindo decidualização, remodelação das artérias espirais uterinas e implantação de embriões. Diferentes subtipos de células uNK exibem funções diferentes, permitindo-lhes coordenar vários eventos biológicos para o desenvolvimento embrionário e a gravidez bem-sucedidos. Portanto, pesquisas aprofundadas sobre os subtipos de células uNK são essenciais para elucidar os mecanismos de regulação imunológica durante a gravidez. Tais estudos fornecem informações valiosas e novas abordagens para abordar condições relacionadas, como infertilidade e insuficiência reprodutiva recorrente. Este artigo apresenta um protocolo detalhado de coloração IHC multiplex para estudar a densidade de quatro subtipos de células uNK em amostras endometriais durante a janela de implantação (WOI). O protocolo inclui preparação de amostras, otimização de marcadores de subtipo, imagens microscópicas e análises de dados. Este protocolo de coloração IHC multiplex oferece alta especificidade e sensibilidade, permitindo a detecção simultânea de diferentes subtipos de células uNK, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para explorar os meandros e mecanismos de regulação imunológica durante a gravidez.

Introdução

O primeiro nascido vivo documentado após fertilização in vitro e transferência de embriões (FIV-ET) foi relatado em 1978. Nos últimos 40 anos, tem havido uma alta demanda pela assistência de FIV-TE entre casais inférteis¹. Em 2021, 238,126 pacientes iniciaram um total de 413,776 ciclos de fertilização in vitro nos Estados Unidos. Isso marca um aumento de 25% nos ciclos em relação aos 2 anos anteriores e um aumento de 135% em relação a 2012². Esse aumento é atribuído principalmente ao aumento da prevalência de infertilidade e ao atraso no planejamento da gravidez. Os avanços nas ....

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Cluster Leste da Universidade Chinesa de Hong Kong-Novos Territórios (CREC ref no.: 2022.581). As mulheres com RIF foram recrutadas no Centro de Tecnologia de Reprodução Assistida, Hospital Príncipe de Gales, Universidade Chinesa de Hong Kong. O RIF foi definido como a falha em alcançar uma gravidez clínica após a transferência de pelo menos 4 embriões de boa qualidade em um mínimo de 3 ciclos frescos ou congelados em uma mulher com menos de 40 anos¹⁰. O consentimento informado foi obtido das participantes antes da coleta das biópsias endometriai....

Discussão

A implantação do embrião envolve uma interação complexa entre o embrião e o endométrio. O estado imunológico da homeostase endometrial desempenha um papel fundamental na determinação da receptividade endometrial. Durante a WOI, a população predominante de leucócitos no endométrio são as células NK. Aproximadamente 90% das células uNK exibem alta expressão de CD56, mas não possuem CD16. No entanto, um subconjunto menor de células uNK se assemelha às células NK do san.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining