반복적인 착상 실패가 있는 여성의 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용한 4가지 자궁 NK 세포 아형 측정

요약

이 연구는 고급 다중 형광 면역조직화학 염색 기술을 사용하여 착상 기간 동안 자궁 자연 살해 세포 하위 집합을 정량화하는 선구적인 방법을 제시합니다.

초록

면역조직화학(IHC)은 생물학 연구 및 임상 진단에서 중요한 역할을 하며, 조직 항원을 식별하고 시각화하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 기존의 IHC 염색 방법은 면역 세포의 다양한 하위 유형을 구별하는 데 한계가 있습니다. 이러한 과제로 인해 과학자들은 면역 세포 아형의 정확한 식별 및 분화를 위한 새로운 기술과 방법론을 탐구하게 되었습니다. 최근 몇 년 동안 멀티플렉스 IHC가 동일한 조직 샘플 내에서 여러 항원을 동시에 검출하고 시각화할 수 있는 솔루션으로 부상했습니다. 자궁 자연살해(uNK) 세포는 탈이원화(decidualization), 자궁 나선형 동맥 리모델링, 배아 착상 등 임신 초기 과정에서 중추적인 역할을 합니다. uNK 세포의 아형에 따라 기능이 다르기 때문에 성공적인 배아 발달과 임신을 위해 다양한 생물학적 사건을 조정할 수 있습니다. 따라서 임신 중 면역 조절 기전을 규명하기 위해서는 uNK 세포 아형에 대한 심도 있는 연구가 필수적입니다. 이러한 연구는 불임 및 재발성 생식 부전과 같은 관련 상태를 해결하기 위한 귀중한 통찰력과 새로운 접근 방식을 제공합니다. 이 논문은 이식 기간(WOI) 동안 자궁내막 검체에서 uNK 세포의 4가지 하위 유형 밀도를 연구하기 위한 상세한 다중 IHC 염색 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜에는 시료 준비, subtype marker 최적화, 현미경 이미징 및 데이터 분석이 포함됩니다. 이 멀티플렉스 IHC 염색 프로토콜은 높은 특이성과 감도를 제공하여 다양한 uNK 세포 아형을 동시에 검출할 수 있도록 하여 연구자에게 임신 중 면역 조절의 복잡성과 메커니즘을 탐구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

서문

체외 수정-배아 이식(IVF-ET) 후 최초로 기록된 출생은 1978년에 보고되었습니다. 지난 40년 동안 불임 부부 사이에서 IVF-ET의 도움에 대한 수요가 높았습니다¹. 2021년에는 미국에서 238,126명의 환자가 총 413,776회의 IVF 주기를 시작했습니다. 이는 2년 전보다 25%, 2012년 대비 135% 증가한 수치입니다². 이러한 급증은 주로 불임 유병률의 증가와 임신 계획 지연에 기인합니다. 배아 배양 기술과 과배란 프로토콜의 발전으로 ET 주기당 출생률이 증가하여 40세 미만 여성의 경우 30%-50%, 40세 이상 여성의 경우 30% 미만에 이르렀습니다². 그러나 이러한 발전에도 불구하고 이식된 배아의 절반 이상이 여전히 착상에 실패하고 있습니다. 반복성 착상 실패(RIF)는 일반적으로 고품질 배아를 3회 이상 연속으로 이식하려는 시도 후 실패로 정의되며, IVF-ET³를 받은 여성의 15%에 영향을 미친다. RIF가 있는 부부는 매우 취약하며 과도한 위험에 노출될 수 있는 비싸고 불필요한 시술을 받는 경향이 더 많습니다⁴. 따라서 RIF의 원인을 이해하고 배아 착상을 개선하는 것은 특히 RIF가 있는 여성의 경우 IVF-ET의 성공을 높이는 데 매우 중요합니다. 자궁내막의 준비는 성공적인 배아 착상을 위해 매우 중요합니다. 이 과정은 자궁자연살해(uNK) 세포의 상당한 축적을 특징으로 하며, 이 세포는 분비 중기 동안 자궁내막의 총 림프구의 30%를 구성하던 것에서 임신 초기에는 낙엽의 70%-80%로 전환된다⁵. 특히 uNK 세포는 선천성 면역 체계에 중요한 세포독성 림프구인 말초 NK 세포와 다르며, 이는 용해 또는 세포 사멸을 통해 감염된 세포를 사멸시킵니다. uNK 세포의 정확한 기능은 아직 완전히 밝혀지지 않았지만, 여러 증거에 따르면 uNK 세포는 혈관 신생 재형성, 영양 세포 침습 및 태아 발달에 관여한다⁶. 기질 세포에 대한 uNK 세포의 비율과 RIF 사이의 연관성은 지난 20년 동안 광범위한 관심을 끌었습니다. 604명의 여성을 대상으로 한 8건의 연구가 포함된 최근의 메타 분석에 따르면, RIF 감염 여성은 황체 중기에 CD56+uNK 세포의 밀도가 가임 대조군에 비해 유의하게 증가하는 것으로 나타났다⁷. 그러나 황체기 중기에 있는 uNK 세포의 특징은 낙엽 NK 세포(dNK) 세포의 특성과 크게 다르다는 점에 유의해야 합니다. 임신 후 uNK 세포가 dNK 세포의 다양한 부분집합으로 더 분화할 수 있지만, uNK 세포를 단독으로 측정하는 것만으로는 dNK 세포를 정확하게 나타낼 수 없다⁸. uNK 세포는 동적 분화를 거치고 월경 주기와 탈결 과정에서 다양한 역할을 하기 때문에 CD56만으로 식별할 수 있는 것보다 더 복잡합니다. 자궁내막 준비 중 uNK 세포의 거동을 종합적으로 이해하기 위해서는 여러 마커가 필요합니다. 우리의 최근 연구는 월경 주기 전반에 걸쳐 uNK 세포의 다양성을 확인하기 위해 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용했습니다. 유세포 분석을 사용하여 검증된 결과, uNK 세포의 4가지 뚜렷한 아형이 존재하며, 각 아형은 월경 주기 동안 동적 변화를 나타낸다⁹. 유전자 농축 분석 및 유전자 온톨로지 기능 강화는 이러한 uNK subset이 월경의 다양한 단계에서 다른 기능을 수행한다는 것을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 유세포 분석은 임상 실험실에서 보편적으로 접근할 수 없으며, 효소 소화를 위해 새로운 자궁내막 조직을 즉시 처리하기 때문에 오류 발생 시 실험 단계를 반복할 수 없습니다.

따라서 이 연구의 목적은 보다 실용적인 진단 접근법을 제공하는 다중 염색 분석을 사용하여 NK 세포의 이러한 4가지 하위 집단의 측정값을 조사하는 것이었습니다. 다중 염색에서는 각 표적에 대한 서로 다른 특정 항체가 특정 파장의 빛에 의해 여기될 때 다른 파장의 빛을 방출하는 서로 다른 형광단 라벨에 연결됩니다. 기존의 IHC 염색법과 비교했을 때, 이 방법은 샘플에서 여러 표적의 상대적 존재도와 분포를 정량적으로 비교하고 서로 다른 표적의 상호 작용 및 공동 국소화에 대한 정보를 제공하여 uNK 세포의 다양한 하위 유형을 식별할 수 있습니다. 이 접근법은 uNK 세포와 RIF 간의 관계에 대한 이해를 심화시킬 뿐만 아니라 자궁내막 관련 질환에서 다른 면역 세포 하위 집단을 조사하기 위한 통찰력을 제공할 것입니다.

프로토콜

이 연구는 Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee(CREC 참조 번호: 2022.581)의 승인을 받았습니다. RIF를 가진 여성은 홍콩 중문대학교의 프린스 오브 웨일즈 병원(Prince of Wales Hospital)의 보조생식기술센터(Assisted Reproductive Technology Center)에서 모집되었습니다. RIF는 40세 미만의 여성에서 최소 3회의 신선 또는 냉동 주기를 통해 최소 4개의 양질의 배아를 이식한 후 임상적 임신을 달성하지 못하는 것으로 정의되었다¹⁰. 자궁내막 생검을 수집하기 전에 참가자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 자궁내막 검체의 채취 및 처리

1. 자궁내막 검체 채취 시기
   1. 연구 참가자 간의 일관성을 보장하기 위해 엄격한 프로토콜에 따라 자궁내막 샘플을 수집합니다. 자연 주기가 있는 환자의 경우 월경 주기^9일째부터 소변 검사를 실시하고 LH 급증(LH+7)¹¹ 후 7^일째 되는 날에 자궁내막 생검을 실시합니다. 호르몬 대체 요법(HRT) 주기를 받는 환자의 경우, 월경 주기 2일째부터 매일 6mg의 에스트라디올 발레레이트를 경구 투여합니다.
   2. 월경 주기의 13일째에 초음파로 자궁내막 두께를 평가합니다. 자궁내막 두께가 8mm에 도달하거나 초과하면 프로게스테론을 질식으로 투여하고 프로게스테론 투여 5일 후 자궁내막 생검을 실시한다¹².
2. 자궁내막 검체 채취 및 고정: 피펫 샘플러를 자궁강에 도입하여 자궁저부 영역으로 전진시킵니다. 내부 플런저를 아래로 당겨 흡입을 가하는 동시에 자궁강 내의 회전 및 수직 움직임을 통해 자궁내막 표면을 긁어냅니다. 채취한 검체를 생리식염수로 헹구어 자궁경부 및 자궁 분비물을 제거합니다. 샘플을 측정하고 크기를 평가합니다. 3 mm x 15-25 mm 샘플의 경우 즉시 10 mL의 10% 중성 완충 포르말린에 담그고 실온에서 24-48시간 동안 고정합니다.
3. 탈수: 고정이 완료되면, 샘플을 대상으로 물을 에탄올로 대체하도록 고안된 탈수 과정을 거칩니다. 이렇게 하려면 조직을 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올 욕조에 담가 완전한 탈수를 보장합니다. 최종 에탄올 수조 후 자일렌의 샘플을 청소하여 잔류 알코올을 제거하고 파라핀 침투를 준비합니다.
4. 임베딩: 조직을 금형 바닥에 평평하게 놓은 후 파라핀을 녹이고 조심스럽게 샘플에 추가하여 자궁내막 조직이 파라핀 매트릭스에 완전히 캡슐화되도록 합니다. 금형에 파라핀 왁스를 채운 후 냉동 테이블에서 냉각하여 파라핀 왁스의 응고를 촉진합니다. 파라핀 블록이 굳으면 추가 처리가 필요할 때까지 실온에서 보관하십시오.
   참고: 사용된 금형은 자궁내막 조직이 접히지 않고 바닥에 평평하게 놓일 수 있도록 얻어진 자궁내막 샘플의 크기를 수용하기 위해 특별히 선택되었으며, 따라서 불필요한 과잉을 생성하지 않고 후속 절편을 위한 최적의 방향을 보장합니다.
5. 절단: 절단을 준비하려면 파라핀 블록을 4°C에서 2시간 동안 냉장 보관합니다. 마이크로톰을 사용하여 샘플을 4μm 섹션으로 자른 다음 42°C로 데운 증류수 표면의 슬라이스를 평평하게 펴고 접착 유리 슬라이드에 장착합니다. 슬라이스를 슬라이드 건조기에 밤새 올려 놓고 사용하기 전에 실온에서 보관하십시오.

2. 다중 면역조직화학 조건의 최적화

1. IHC 검증: IHC 염색 파라미터의 검증을 위해 항원 검색, 항체 농도 및 배양 시간에 대한 조건을 미세 조정하기 위한 체계적인 접근 방식을 채택합니다.
   1. 제조업체의 권장 희석 범위 내에서 각 항체에 대해 2-3 농도를 테스트합니다. pH 6 및 pH 9에서 완충액을 비교하여 항원 회수를 최적화하고, 실온에서 1.5시간 및 4°C에서 야간에 배양 프로토콜을 평가합니다.
   2. 염색 강도, 특이성 및 배경 소음에 중점을 두고 각 상태를 꼼꼼하게 평가합니다. 최소한의 비특이적 결합으로 가장 명확하고 특이적인 염색을 제공하는 최적의 조합을 선택하십시오. 이 엄격한 검증은 IHC 프로토콜에서 최고의 정확성과 재현성을 보장했습니다.
2. 티라미드 신호 증폭(TSA) 모노플렉스 염색: 개별 항체에 대한 최적의 염색 파라미터를 결정한 후 다른 TSA 염료와 항체의 쌍을 최적화합니다. 발현이 더 높은 마커를 형광 강도 수준이 더 낮은 염료와 짝을 이루거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이 단계에서는 관찰된 형광 신호 강도에 따라 항체 농도와 배양 시간을 조정합니다. 중요한 배경 또는 비특이적 염색이 관찰되면 쌍을 이루는 염료¹³을 변경하십시오.
3. TSA 다중 염색: 다중 면역조직화학(m-IHC) 프로토콜의 경우, 확립된 원칙에 따라 염색의 순차적 순서가 신중하게 정의되었습니다. multiplexing 과정이 single-label staining의 민감도와 특이성을 반영하도록 하기 위해, 염색 시퀀스 시작 시 발현 수준이 낮은 항체를 우선적으로 선택했습니다. 염기 복구가 필요한 항체는 염기 복원이 경우에 따라 비특이적 염색 아티팩트를 증폭할 수 있는 산 기반 방법에 비해 강력하기 때문에 항원 회수를 위해 염기 복구가 필요한 항체를 염색 시퀀스의 끝에 배치합니다.
4. 2.1 및 2.2 단계의 결과를 사용하여 항원 검색 요구 사항 및 발현 밀도를 기반으로 사용할 항체와 단계를 결정합니다. 예를 들어, 항원 회수를 위해 염기 복구가 필요한 CXCR4 항체는 염색의 최종 단계에 배치되었습니다. 반대로, 낮은 발현 밀도를 특징으로 하는 CD49a 항체는 염색 서열에서 첫 번째 위치를 차지합니다. 성공적인 탐지 가능성을 최대화하고 다중화 절차의 후반 단계에서 발생할 수 있는 마스킹 효과를 최소화합니다.
5. 나머지 항체의 경우 최적화 단계에서 다양한 조합을 테스트하여 민감도와 특이성의 균형을 맞추는 가장 효과적인 염기서열을 결정합니다. 이러한 비교 분석의 결과는 표 1에 자세히 설명된 대로 멀티플렉스 패널의 최종 구성을 안내하여 선택한 패널이 배경을 최소화하면서 최적의 성능을 제공하는지 확인합니다.

3. m-IHC 프로세스

1. 탈랍, 수분 공급 및 고정: 조직 절편을 60°C에서 2시간 동안 굽은 다음 자일렌 I(10분), 자일렌 II(10분), 100% 에탄올(5분), 95% 에탄올(5분), 80% 에탄올(5분), 75% 에탄올(5분), ddH_2O(3x의 경우 2분), 10% 중성 완충 포르말린(최소 20분), 및 ddH₂O(2x의 경우 3분).
2. 항원 회수: 각 항체에 대해 표 1 에 나열된 대로 각각의 AR6 또는 AR9 완충액 200mL를 내열성 항원 회수 카세트에 추가합니다. 섹션을 적절한 항원 검색 버퍼에 넣고 끓을 때까지 약 2분 동안 고출력의 전자레인지에서 가열합니다. 그런 다음 카세트를 느슨하게 덮고 저전력으로 15분 동안 가열한 다음 실온으로 식힙니다. ddH₂O 및 PBST로 절편을 헹굽니다.
3. 소수성 장벽 그리기: 흡수성 종이로 여분의 용액을 제거한 후 소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 주위에 완전한 원을 그립니다.
4. 내인성 효소 활성의 불활성화: 절편을 3% 과산화수소로 처리하고 실온에서 8분 동안 배양합니다. PBST로 각각 2분씩 3회 세척합니다.
5. 비특이적 부위 차단: 흡수지로 건조 후 차단액(1x Antibody Diluent/Block)을 도포하고 상온에서 10분간 배양합니다.
6. 1차 항체로 배양: 차단 용액을 제거한 후 첫 번째 1차 항체인 CD49a 150 μL를 1x Antibody Diluent에서 1:1000으로 희석하여 각 슬라이드에 적용합니다. 섹션 2에서 이전에 최적화한 대로 배양합니다. 배양 후 PBST로 슬라이드를 각각 2분 동안 3회 세척합니다. 나머지 항체에 대해서는 특정 희석 비율에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
7. 2차 항체로 배양: 2차 항체를 적용하기 전에 흡수지를 사용하여 과도한 수분을 제거하여 시약의 희석을 방지합니다. 각 슬라이드에 1x Anti-Ms + Rb HRP 2차 항체 4-5방울(약 150μL)을 첨가한 후 실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 각 2분 동안 PBST로 3회 세척합니다.
   참고: 1x Anti-Ms + Rb HRP 2차 항체는 토끼 및 마우스 1차 항체에 특이적입니다.
8. TSA 염료로 신호 증폭: 과도한 수분을 블로팅한 후 증폭 희석액에 TSA 염료를 1:100으로 희석합니다. 이 희석된 TSA 염료 용액 150μL를 각 슬라이드에 추가합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. PBST로 각각 2분씩 3회 세척합니다.
9. 해당 항체 및 염료를 사용하여 TSA 절차에 대해 3.2 및 3.5-3.8 단계를 반복합니다.
10. 염색 핵: 마지막 항체를 염색한 후 내열 카세트 내의 AR6 완충액 200mL의 섹션을 전자레인지에 돌리고 2분 동안 끓인 다음 15분 동안 저전력 가열하여 결합되지 않은 형광단을 제거합니다. 샘플을 실온으로 냉각하고 ddH₂O 및 PBST로 헹굽니다. PBST(1:10)에 희석한 DAPI 작업 용액 150μL를 적하에 넣고 실온에서 10분 동안 배양한 다음 ddH_2O로 2배 헹굽니다.
11. 장착: 섹션이 어두운 곳에서 약 30분 동안 완전히 공기 건조되면 담금질 방지 형광 마운턴트를 한 방울(약 30μL) 바르고 커버슬립을 놓습니다.
    알림: TSA 염료를 처음 도포한 후에는 모든 작업을 빛으로부터 보호하십시오. 신속한 관찰과 이미지 캡처는 형광 소멸을 방지하기 위해 염색 후 완료에 필수적이었습니다.

4. 이미지 획득 및 분석

1. Exposure time(노출 시간): 형광단에 해당하는 excitation 및 emission 파장을 상속하는 이미저를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 노출 시간을 설정할 때 정확성을 보장하기 위해 다양한 마커 표현이 있는 슬라이드를 확인하십시오. 각 마커/필터 조합에 대해 슬라이드의 다른 영역에 수동으로 초점을 맞춥니다. 자동 노출 기능을 사용하여 노출 시간을 설정합니다.
2. TSA 염료에 따라 필터를 선택하고 여러 슬라이드를 검사하여 채널당 최적의 노출 시간을 결정합니다. 이러한 설정을 모든 후속 획득에 일관되게 적용하여 이미징 전반에 걸쳐 비교 가능성을 유지할 수 있습니다.
3. 캡처 영역 선택: 조직 절편 전반에 걸쳐 편향되지 않은 샘플링을 보장하고 분석된 각 필드에 발광 상피를 일관되게 포함하려면 이미지 획득을 위한 초기 영역을 무작위로 선택하며, 중요한 기준은 발강 상피 경계의 존재입니다.
4. 이 초기 필드를 캡처한 후에는 프레임 내의 내강 상피 테두리를 유지하면서 하나의 필드를 시작점의 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동하여 후속 영역을 체계적으로 선택합니다(캡처된 각 이미지 사이에 하나의 필드 생략). 이 프로세스를 반복하여 각각 발광 상피의 적어도 일부를 포함하는 최소 5개의 서로 다른 영역을 캡처하여¹⁴개 전체에 걸쳐 일관된 분석 깊이를 유지합니다. 이 접근 방식은 포괄적이고 대표적인 데이터 수집을 보장하기 위해 캡처된 모든 필드에 걸쳐 최소 약 10,000개의 기질 세포를 포함하는 것을 목표로 했습니다.
5. 이미지 분석
   1. 이미지 준비: 다중 스펙트럼 이미지를 가져오고 분석하려면 먼저 소프트웨어 인터페이스에서 File > Open Image로 이동하여 파일과 자가형광(AF) 슬라이드를 로드합니다. 이미지를 업로드한 후 Select Fluors 버튼을 클릭하고 적절한 스펙트럼 라이브러리를 선택하여 형광단의 혼합을 해제합니다. 모든 형광단이 선택되면 OK(확인)를 클릭하여 선택을 확인합니다. AF 스펙트럼을 분리하려면 AF 스포이드 도구를 사용하여 AF 이미지에서 대표적인 조직 영역을 샘플링하고 조직이 아닌 픽셀은 제외하도록 주의합니다. 샘플링 후 인터페이스¹⁵의 왼쪽 하단 모서리에 있는 이미지 준비 또는 모두 준비를 클릭합니다.
   2. 조직 분할: 상피 세포가 포함된 상피 영역, 기질 세포가 포함된 기질 영역 및 세포 함량이 없는 빈 영역을 포함하여 이미지 내에서 조직 유형당 3-5개 영역의 기준선을 수동으로 묘사하여 분할 프로세스를 시작합니다. 초기 세분화 결과가 만족스럽지 않은 경우 추가 영역에 수동으로 주석을 달아 훈련 데이터 세트를 개선함으로써 후속 분석의 정확성과 신뢰성을 높일 수 있습니다. 이러한 영역과 파라미터의 동적 조정은 소프트웨어가 현재 및 다른 가져온 이미지에서 유사한 구조를 자동으로 식별하여 향상된 정확도로 식별할 수 있도록 합니다.
      참고: 초기 주석은 소프트웨어가 각 조직 구성 요소의 특성을 학습하기 위한 교육 데이터 세트 역할을 합니다. 그런 다음 소프트웨어의 세분화 기능은 조직의 복잡성과 변동성에 따라 반복적으로 개선됩니다.
   3. Cell Segmentation(셀 분할): Segment Cells(셀 세그먼트)를 클릭하여 셀 분할을 시작합니다. Cell Segmentation Setting(세포 분할 설정)에서 Nuclei and Membrane(핵 및 멤브레인)을 선택합니다. DAPI를 선택하여 세포핵을 식별하고 배경 잡음 없이 모든 세포핵을 검출하도록 강도 설정을 조정합니다. CD16, CD49a 및 CD56 신호를 선택하여 멤브레인을 찾고 이 신호를 사용하여 핵 분할을 지원합니다. 핵 구성 요소 분할 기능을 사용하여 밀접하게 위치한 핵을 구별할 수 있습니다.
      참고: DAPI는 셀 내부를 강조 표시합니다. 핵 구성 요소 분할 기능은 세포핵이 서로 가까이 있거나 병합된 것처럼 보일 때 세포핵을 구별하는 데 도움이 됩니다. 이 단계는 신뢰할 수 있는 세포 수를 얻고 분석의 무결성을 유지하는 데 중요합니다.
   4. 세포 표현형: CD56, CD49a, CXCR4 및 CD16을 포함한 4가지 세포 표면 마커를 채택하여 NK 세포의 다양한 아형을 구별합니다. Phenotyping Scheme에서 이 4개의 마커를 진행할 표현형으로 레이블을 지정합니다. Associate View 섹션에서 식별을 위해 각 표현형에 특정 색상을 할당합니다. Add 버튼을 사용하여 셀을 마커를 양수 또는 음수로 표현하는 것으로 분류합니다. 예를 들어, CD56 표현형에서 세포는 CD56+ 또는 CD56-로 표지될 수 있습니다. 훈련 과정에서 각 표현형에 대해 최소 5개의 세포를 수동으로 레이블링합니다. 초기 훈련에서 효과적인 결과를 얻지 못하는 경우 추가 수동 레이블 지정을 수행합니다.
   5. 세포 표현형 구성이 설정된 후 이미지의 각 셀은 4개의 표면 마커가 양수 또는 음수로 발현되는지 여부를 나타냅니다. 추가 분석을 위해 결과 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
   6. 데이터 처리: 모든 이미지에서 얻은 데이터를 스프레드시트로 가져와 처리합니다. 이미지의 총 셀 수를 기준으로 모든 uNK 셀 하위 유형의 백분율을 계산합니다. 최종 세포 수는 여러 이미지의 평균 세포 수를 나타내며 샘플 내 다양한 uNK 세포 아형의 모집단에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다.

결과

자연 주기를 겪는 여성의 자궁내막 검체 채취 시기의 일관성을 유지하기 위해 황체 형성 호르몬(LH) 급증을 정확하게 감지하기 위해 소변 검사를 수행했으며, LH 급증 후 7일 후에 자궁내막 생검을 실시했습니다. HRT 주기를 겪는 여성의 경우, 프로게스테론 보충이 시작된 후 정확히 5일 후에 샘플을 예약했습니다. 자궁내막에 있는 NK 세포의 다양한 아형을 정량화하기 위해 m...

토론

배아 착상은 배아와 자궁 내막 사이의 복잡한 상호 작용을 포함합니다. 자궁내막 항상성의 면역학적 상태는 자궁내막 수용성을 결정하는 데 중추적인 역할을 합니다. WOI 기간 동안 자궁내막에서 가장 우세한 백혈구 집단은 NK 세포입니다. uNK 세포의 약 90%는 CD56 발현이 높지만 CD16은 부족합니다. 그러나 uNK 세포의 일부 부분집합은 말초 혈액 NK 세포와 유사하여 CD56 발현은 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining