移植失敗を繰り返す女性におけるマルチプレックス蛍光免疫組織化学染色を用いた4つの子宮NK細胞サブタイプの測定

要約

この研究は、高度なマルチプレックス蛍光免疫組織化学染色技術を使用して、移植期間中に子宮ナチュラルキラー細胞サブセットを定量化するための先駆的な方法を提示します。

要約

免疫組織化学(IHC)は、生物学的研究と臨床診断において重要な役割を果たしており、組織抗原を同定および視覚化するために最も一般的に使用される方法として機能します。しかし、従来のIHC染色法では、免疫細胞のさまざまなサブタイプを区別することに限界があります。この課題により、科学者は免疫細胞のサブタイプの正確な同定と分化のための新しい技術と方法論を探求するようになりました。近年、マルチプレックスIHCがソリューションとして登場し、同じ組織サンプル内で複数の抗原を同時に検出し、それらを可視化することが可能になりました。子宮ナチュラルキラー(uNK)細胞は、脱落膜化、子宮螺旋動脈のリモデリング、胚着床など、妊娠初期のプロセスにおいて極めて重要な役割を果たします。uNK細胞のサブタイプが異なれば、機能も異なるため、胚の発生と妊娠を成功させるためのさまざまな生物学的イベントを調整することができます。したがって、妊娠中の免疫制御メカニズムを解明するためには、uNK細胞のサブタイプに関する詳細な研究が不可欠です。このような研究は、不妊症や再発性生殖不全などの関連疾患に対処するための貴重な洞察と新しいアプローチを提供します。この論文では、移植期間中の子宮内膜標本中のuNK細胞の4つのサブタイプの密度を研究するための詳細なマルチプレックスIHC染色プロトコルを紹介します。このプロトコールには、サンプル調製、サブタイプマーカーの最適化、顕微鏡イメージング、およびデータ解析が含まれます。このマルチプレックスIHC染色プロトコルは、高い特異性と感度を提供し、異なるuNK細胞サブタイプの同時検出を可能にし、研究者に妊娠中の免疫調節の複雑さとメカニズムを探求するための強力なツールを提供します。

概要

体外受精胚移植(IVF-ET)後の最初の文書化された出生は、1978年に報告されました。過去40年以上にわたり、不妊症のカップルの間でIVF-ETの支援に対する高い需要がありました¹。2021年には、238,126人の患者が米国で合計413,776回のIVFサイクルを開始しました。これは、サイクルが2年前から25%増加し、2012年から135%増加した^{ことを示しています2。}この急増は、主に不妊症の有病率の上昇と妊娠計画の遅れに起因しています。胚培養技術と超排卵プロトコルの進歩により、ETサイクルあたりの出生率は増加し、40歳未満の女性では30〜50%、40歳以上の女性では30%未満に達しました²。しかし、これらの進歩にもかかわらず、移植された胚の半数以上は依然として着床に失敗しています。反復着床失敗(RIF)は、通常、高品質の胚移植を3回以上連続して試みた後の失敗と定義され、IVF-ET^を受ける女性の15%が罹患しています3。RIFのカップルは非常に脆弱で、費用がかかり不必要な手順を受ける傾向があり、過度のリスクにさらされる可能性があります⁴。したがって、RIFの原因を理解し、胚着床を改善することは、特にRIFの女性にとって、IVF-ETの成功を高めるために重要です。子宮内膜の準備は、胚の着床を成功させるために重要です。このプロセスは、子宮ナチュラルキラー(uNK)細胞の大幅な蓄積を特徴とし、分泌期中期の子宮内膜の全リンパ球の30%から妊娠初期の脱落膜の70%〜80%に移行します⁵。特に、uNK細胞は末梢NK細胞とは異なり、末梢NK細胞は、溶解またはアポトーシスによって感染細胞を死滅させる自然免疫系にとって重要な細胞傷害性リンパ球です。uNK細胞の正確な機能はまだ完全には解明されていませんが、いくつかの証拠は、それらが血管新生のリモデリング、栄養膜浸潤、および胎児の発育に関与していることを示唆しています⁶。間質細胞に対するuNK細胞の割合とRIFとの関連は、過去20年間で大きな注目を集めてきました。604人の女性を対象とした8件の研究を含む最近のメタアナリシスでは、RIFの女性では、中期黄体期のCD56+uNK細胞の密度が、受胎可能な対照群と比較して有意に増加していることが示されました⁷。ただし、中期黄体期のuNK細胞の特性は、脱落膜NK(dNK)細胞の特性とは大きく異なることに注意することが重要です。uNK細胞は妊娠後にさらにdNK細胞の種々のサブセットに分化する可能性があるが、uNK細胞を測定するだけではdNK細胞を正確に表すことはできない⁸。uNK細胞はダイナミックな分化を受け、月経周期と脱落膜プロセスで異なる役割を果たすため、CD56だけでは同定できないほど複雑になります。子宮内膜調製中のuNK細胞の挙動を包括的に理解するためには、複数のマーカーが必要です。私たちの最近の研究では、月経周期全体にわたるuNK細胞の多様性を特定するために、シングルセルRNAシーケンシングを採用しました。フローサイトメトリーを用いて検証された結果は、uNK細胞の4つの異なるサブタイプの存在を示しており、それぞれが^{月経周期中に}動的な変化を示す9。遺伝子濃縮解析と遺伝子オントロジーの機能濃縮は、これらのuNKサブセットが月経のさまざまな段階で異なる機能を果たしていることを示しています。それにもかかわらず、フローサイトメトリーは臨床検査室で広く利用されているわけではなく、酵素消化のために新鮮な子宮内膜組織をすぐに処理することで、エラー時に実験手順を繰り返すことは不可能になります。

したがって、この研究の目的は、より実用的な診断アプローチを提供するマルチプレックス染色アッセイを使用して、NK細胞のこれら4つの亜集団の測定を調査することでした。マルチプル染色では、各ターゲットに対する異なる特異的抗体が、特定の波長の光によって励起されると異なる波長の光を放出する異なる蛍光色素標識に結合されます。従来のIHC染色法と比較して、この方法では、サンプル中の複数のターゲットの相対的な存在量と分布を定量的に比較し、異なるターゲットの相互作用と共局在に関する情報を提供できるため、uNK細胞のさまざまなサブタイプを同定することができます。このアプローチは、uNK細胞とRIFとの関係についての理解を深めるだけでなく、子宮内膜関連疾患における他の免疫細胞亜集団を調査するための洞察も提供します。

プロトコル

この研究は、香港新界合同中文大学東クラスター臨床研究倫理委員会(CREC ref no.:2022.581)によって承認されました。RIFの女性は、香港中文大学プリンスオブウェールズ病院の生殖補助医療センターから募集されました。RIF は、40 歳未満の女性において、少なくとも 3 回の新鮮または凍結サイクルで少なくとも 4 つの良質な胚を移植した後、臨床妊娠を達成できなかったと定義されました¹⁰。インフォームドコンセントは、子宮内膜生検を収集する前に参加者から得られました。

1. 子宮内膜サンプルの取得と処理

1. 子宮内膜検体採取のタイミング
   1. 厳格なプロトコルに従って子宮内膜サンプルを収集し、研究参加者間の一貫性を確保します。自然周期の患者の場合、月経周期の9^日目 から尿検査を行い、LHサージ(LH + 7)の7^日目 に子宮内膜生検を行います¹¹ 。ホルモン補充療法(HRT)サイクルを受けている患者には、月経周期の2日目から毎日6 mgのエストラジオール吉草酸エスプレレートを経口投与します。.
   2. 月経周期の13日目に超音波検査で子宮内膜の厚さを評価します。子宮内膜の厚さが8mmに達するかそれを超えたら、プロゲステロンを経膣的に投与し、プロゲステロン投与の5日後に子宮内膜生検を行う¹²。
2. 子宮内膜サンプルの収集と固定:ピペットサンプラーを子宮腔内に導入し、それを子宮底領域まで前進させます。内部プランジャーを引き下げて吸引し、同時に子宮腔内の回転運動と垂直運動によって子宮内膜表面を掻き取ります。採取した標本を生理食塩水ですすいで、子宮頸部と子宮の分泌物を排除します。サンプルを測定し、サイズを評価します。3 mm x 15-25 mmのサンプルの場合は、すぐに10 mLの中性緩衝ホルマリン10 mLに浸し、室温で24〜48時間固定します。
3. 脱水:固定が完了したら、水をエタノールに置き換えるように設計された脱水シーケンスにサンプルをさらします。これを行うには、組織を70%、80%、90%、および100%エタノール浴に浸して、完全な脱水を確実にします。最終的なエタノール浴に続いて、サンプルをキシレンで除去して残留アルコールを除去し、パラフィン浸透の準備をします。
4. 埋め込み:組織を型の底に平らに置いた後、パラフィンを溶かし、慎重にサンプルに加えて、子宮内膜組織がパラフィンマトリックスに完全にカプセル化されていることを確認します。型にパラフィンワックスを充填した後、冷凍テーブルで冷却してパラフィンワックスの固化を促進します。パラフィンブロックが固まったら、さらなる処理が必要になるまで室温で保存してください。
   注:使用される型は、得られた子宮内膜サンプルのサイズに対応するように特別に選択され、子宮内膜組織が折り畳まれることなく底に平らに横たわるようにするため、その後の切片作成に最適な向きを確保し、不必要な過剰さを生み出すことなく。
5. 切片化:切片化の準備として、パラフィンブロックを4°Cで2時間冷蔵します。ミクロトームを使用してサンプルを4 μmのセクションにスライスし、続いて42°Cに温めた蒸留水の表面でスライスを平らにし、接着性のスライドガラスに取り付けます。スライスをスライド乾燥機に一晩置き、室温で保管してから使用します。

2. マルチプレックス免疫組織化学条件の最適化

1. IHCバリデーション:IHC染色パラメータのバリデーションでは、抗原賦活化、抗体濃度、インキュベーション時間の条件を系統的に微調整するアプローチを採用します。
   1. メーカーが推奨する希釈範囲内で、各抗体について2〜3の濃度を試験します。pH 6 と pH 9 のバッファーを比較することで抗原賦活化を最適化し、室温で 1.5 時間、室温で 4 °C で一晩インキュベーションプロトコールを評価します。
   2. 各条件を細心の注意を払って評価し、染色の強度、特異性、バックグラウンドノイズに焦点を当てます。最適な組み合わせを選択すると、非特異的結合を最小限に抑えながら、最も明確で特異的な染色が得られます。この厳格な検証により、IHCプロトコルで最高の精度と再現性が保証されました。
2. チラミドシグナル増幅(TSA)モノプレックス染色:個々の抗体の最適な染色パラメータを決定した後、抗体と異なるTSA色素とのペアリングを最適化します。発現量の高いマーカーを蛍光強度の低い色素と組み合わせたり、その逆を行ったりします。この段階では、観察された蛍光シグナル強度に応じて、抗体濃度とインキュベーション時間を調整します。著しいバックグラウンドまたは非特異的染色が観察される場合は、対になった色素¹³を交換する。
3. TSAマルチプレックス染色:マルチプレックス免疫組織化学(m-IHC)プロトコルでは、染色の逐次順序は確立された原則に従って慎重に定義されています。マルチプレックス化プロセスが単一標識染色の感度と特異性を反映するように、染色シーケンスの開始時に発現レベルが低い抗体を優先します。抗原賦活化のために塩基修復が必要な抗体は、酸ベースの方法に比べて塩基修復が堅牢であり、場合によっては非特異的な染色アーティファクトを増幅する可能性があるため、染色配列の最後に配置します。
4. ステップ2.1と2.2の結果を使用して、抗原賦活化要件と発現密度に基づいて、使用する抗体とどの段階で使用するかを決定します。例えば、抗原賦活化のために塩基修復が必要なCXCR4抗体は、染色の最終段階に置かれています。逆に、発現密度が低いことを特徴とするCD49a抗体は、染色配列の最初の位置に与えられています。検出が成功する可能性を最大化し、多重化手順の後の段階で発生する可能性のあるマスキングの影響を最小限に抑えます。
5. 残りの抗体については、最適化フェーズでさまざまな組み合わせをテストして、感度と特異性の両方のバランスが取れた最も効果的な配列を決定します。これらの比較分析の結果は、 表1に詳述されているように、マルチプレックスパネルの最終的な構成を導き、選択したパネルがバックグラウンドを最小限に抑えながら最適なパフォーマンスを提供することを保証します。

3. m-IHCプロセス

1. 脱ロウ、水和、固定:組織切片を60°Cで2時間ベークした後、キシレンI(10分)、キシレンII(10分)、100%エタノール(5分)、95%エタノール(5分)、80%エタノール(5分)、75%エタノール(5分)、ddH₂O(3倍で2分)、10%中性緩衝ホルマリン(少なくとも20分)、 およびddH₂O(3xの場合は2分)。
2. 抗原賦活化:各抗体について 表1 に記載されているように、それぞれのAR6またはAR9バッファー200 mLを耐熱性抗原賦活化カセットに加えます。切片を適切な抗原賦活化バッファーに入れ、電子レンジで高出力で約2分間沸騰するまで加熱します。その後、カセットをゆるく覆い、低電力で15分間加熱し、室温まで冷却します。切片をddH₂OおよびPBSTですすいでください。
3. 疎水性バリアの描画:吸収紙で余分な溶液を取り除いた後、疎水性バリアペンを使用して組織の周りに完全な円を描きます。
4. 内因性酵素活性の不活性化:切片を3%過酸化水素で処理し、室温で8分間インキュベートします。PBSTで3回、各2分間洗浄します。
5. 非特異的部位のブロッキング:吸収紙で乾燥させた後、ブロッキング溶液(1x Antibody Diluent/Block)を塗布し、室温で10分間インキュベートします。
6. 一次抗体とのインキュベーション:ブロッキング溶液を除去した後、1x Antibody Diluentで1:1000の希釈率で1:1000の希釈で、最初の一次抗体CD49a150 μLを各スライドに適用します。セクション2で最適化したようにインキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBST 3xでそれぞれ2分間洗浄します。残りの抗体については、 表1 の比希釈比を参照してください。
7. 二次抗体とのインキュベーション:二次抗体を塗布する前に、試薬の希釈を防ぐために、吸収紙を使用して余分な水分を取り除きます。1x Anti-Ms + Rb HRP二次抗体を各スライドに4〜5滴(約150 μL)加え、室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、PBSTで各2分間3回の洗浄を行います。
   注:1x Anti-Ms + Rb HRP二次抗体は、ウサギおよびマウスの一次抗体に特異的であることに注意してください。
8. TSA色素によるシグナル増幅:余分な水分をブロッティングした後、TSA色素を増幅希釈液で1:100に希釈します。この希釈したTSA色素溶液150μLを各スライドに加えます。室温で10分間インキュベートします。PBSTで3回、各2分間洗浄します。
9. TSAの手順について、対応する抗体と色素を使用して、ステップ3.2と3.5-3.8を繰り返します。
10. 核の染色:最後の抗体を染色した後、耐熱カセット内の200 mLのAR6バッファーで切片を電子レンジで加熱し、2分間煮沸した後、15分間低電力加熱することにより、結合していない蛍光色素分子を除去します。サンプルを室温まで冷却し、ddH₂OおよびPBSTですすいでください。PBST(1:10)で希釈したDAPIワーキング溶液150 μLを滴下し、室温で10分間インキュベートし、ddH₂Oで2回すすぎます。
11. 埋込:切片を暗所で約30分間風乾した後、消光防止蛍光封入剤を1滴(約30μL)塗布し、カバースリップを敷き詰めます。
    注意: TSA染料を最初に塗布した後は、すべての操作を光から保護してください。染色後の染色完了には、蛍光消光を防ぐために迅速な観察と画像取得が不可欠でした。

4. 画像の取得と解析

1. 露光時間:蛍光色素に対応する励起波長と発光波長を継承するイメージャーを使用して画像をキャプチャします。露光時間を設定するときは、マーカー表現が豊富なスライドをチェックして、精度を確認してください。マーカーとフィルターの組み合わせごとに、スライドのさまざまな領域に手動で焦点を合わせます。自動露出機能を使用して、露出時間を設定します。
2. TSA色素に従ってフィルターを選択し、複数のスライドを調べて、チャンネルごとに最適な露光時間を決定します。これらの設定を後続のすべての取得に一貫して適用し、イメージング全体での比較可能性を維持します。
3. キャプチャ領域の選択:組織切片間で偏りのないサンプリングを行い、分析された各フィールドに管腔上皮を一貫して含めるために、画像取得の初期領域をランダムに選択し、重要な基準は管腔上皮境界の存在です。
4. この最初のフィールドをキャプチャした後、フレーム内の管腔上皮境界を維持しながら、1つのフィールドを開始点の左または右に移動(キャプチャされた各画像の間に1つのフィールドを省略)することにより、後続の領域を体系的に選択します。このプロセスを繰り返して、少なくとも5つの異なる領域を捕捉し、それぞれが管腔上皮の少なくとも一部を含み、¹⁴全体で一貫した分析深度を維持します。このアプローチは、包括的で代表的なデータ収集を確実にするために、捕捉されたすべてのフィールドにわたって少なくとも約10,000の間質細胞を含めることを目的としていました。
5. 画像解析
   1. 画像の準備:マルチスペクトル画像をインポートして解析するには、まずソフトウェアインターフェースで [ファイル]>[画像を開く ]に移動して、ファイルと自家蛍光(AF)スライドをロードします。画像をアップロードした後、 Select Fluors ボタンをクリックし、適切なスペクトルライブラリを選択して、蛍光色素のアンミックスに進みます。すべての蛍光色素を選択したら、「 OK 」をクリックして選択を確定します。AFスペクトルを分離するには、AFスポイトツールを使用して、AF画像から組織の代表的な領域をサンプリングし、組織以外のピクセルを除外するように注意します。サンプリング後、をクリックします 画像の準備 or すべて 準備 インターフェイス¹⁵の左下隅にあります。
   2. 組織セグメンテーション:上皮細胞を含む上皮領域、間質細胞を含む間質領域、細胞内容物のない空白領域など、画像内の組織タイプごとに3〜5領域のベースラインを手動で描くことにより、セグメンテーションプロセスを開始します。最初のセグメンテーション結果が満足のいくものでない場合は、追加の領域に手動で注釈を付けてトレーニングデータセットを改善し、後続の分析の精度と信頼性を向上させます。この領域とパラメータの動的な調整により、ソフトウェアは現在の画像と他のインポートされた画像内の類似構造を自動的に識別し、精度を高めることができます。
      注:最初のアノテーションは、ソフトウェアが各組織コンポーネントの特性を学習するためのトレーニングデータセットとして機能します。その後、ソフトウェアのセグメンテーション機能は、組織の複雑さと変動性に基づいて反復的に洗練されます。
   3. セルのセグメンテーション: [セグメントセル] をクリックして、セルのセグメンテーションを開始します。Cell Segmentation Settingで、NucleiとMembraneを選択します。 DAPIを選択して細胞核を特定し、強度設定を調整してバックグラウンドノイズなしですべての細胞核を検出します。CD16、CD49a、CD56のシグナルを選択してメンブレンを見つけ、このシグナルを使用して核分裂を支援します。核成分分割機能を使用して、近接した位置にある原子核を区別します。
      注:DAPIはセルの内側を強調表示します。核成分の分割機能は、細胞核が互いに接近している場合や結合しているように見える場合に、細胞核を区別するのに役立ちます。このステップは、信頼性の高い細胞数を取得し、分析の完全性を維持するために重要です。
   4. 細胞表現型解析:CD56、CD49a、CXCR4、CD16を含む4つの異なる細胞表面マーカーを採用して、NK細胞のさまざまなサブタイプを区別します。表現型決定スキームでは、これらの4つのマーカーを表現型としてラベル付けし、進めます。「アソシエイトビュー」セクションで、識別のために各表現型に特定の色を割り当てます。[追加] ボタンを使用して、マーカーを正または負に表現しているセルに分類します。例えば、CD56表現型では、細胞をCD56+またはCD56−として標識することができる。トレーニングプロセス中に、表現型ごとに少なくとも5つの細胞を手動で標識します。初期トレーニングで効果的な結果が得られない場合は、追加の手動ラベル付けを実行します。
   5. 細胞表現型の設定が完了すると、画像内の各セルは、4つの表面マーカーが正に発現しているか負に発現しているかを示します。結果のデータをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析します。
   6. データ処理:すべての画像から取得したデータをスプレッドシートにインポートして処理します。画像内の細胞の総数に対するすべてのuNK細胞サブタイプの割合を計算します。最終的な細胞数は、複数の画像の平均数を表し、サンプル内のさまざまなuNK細胞サブタイプの集団の包括的な概要を提供します。

結果

自然周期を経る女性の子宮内膜サンプル採取のタイミングを一定に保つために、黄体形成ホルモン(LH)サージを正確に検出するための尿検査を実施し、LHサージの7日後に子宮内膜生検を実施しました。HRTサイクルを受けている女性の場合、サンプルはプロゲステロン補給開始のちょうど5日後にスケジュールされました。子宮内膜内のNK細胞のさまざまなサブタイプを?...

ディスカッション

胚着床には、胚と子宮内膜との間の複雑な相互作用が含まれます。子宮内膜の恒常性の免疫学的状態は、子宮内膜の受容性を決定する上で極めて重要な役割を果たします。WOI期間中、子宮内膜の主な白血球集団はNK細胞です。uNK細胞の約90%は高いCD56発現を示しますが、CD16は欠如しています。しかし、uNK細胞のマイナーなサブセットは末梢血NK細胞に似ており、CD56の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining