Misurazione di quattro sottotipi di cellule NK uterine mediante colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata in donne con ripetuti fallimenti di impianto

Riepilogo

Questo studio presenta un metodo pionieristico per quantificare i sottogruppi di cellule natural killer uterine durante la finestra di impianto utilizzando tecniche avanzate di colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata.

Abstract

L'immunoistochimica (IHC) svolge un ruolo cruciale nella ricerca biologica e nella diagnosi clinica, essendo il metodo più comunemente usato per identificare e visualizzare gli antigeni tissutali. Tuttavia, i metodi tradizionali di colorazione IHC hanno dei limiti nel distinguere i vari sottotipi di cellule immunitarie. Questa sfida ha spinto gli scienziati a esplorare nuove tecnologie e metodologie per l'identificazione e la differenziazione precise dei sottotipi di cellule immunitarie. Negli ultimi anni, l'IHC multiplex è emerso come una soluzione, che consente il rilevamento simultaneo di più antigeni e la loro visualizzazione all'interno dello stesso campione di tessuto. Le cellule natural killer uterine (uNK) svolgono un ruolo fondamentale nei processi iniziali della gravidanza, tra cui la decidualizzazione, il rimodellamento delle arterie spirali uterine e l'impianto dell'embrione. Diversi sottotipi di cellule uNK mostrano funzioni diverse, consentendo loro di coordinare vari eventi biologici per il successo dello sviluppo embrionale e della gravidanza. Pertanto, una ricerca approfondita sui sottotipi di cellule uNK è essenziale per chiarire i meccanismi di regolazione immunitaria durante la gravidanza. Tali studi forniscono preziose informazioni e nuovi approcci per affrontare condizioni correlate come l'infertilità e l'insufficienza riproduttiva ricorrente. Questo articolo introduce un protocollo dettagliato di colorazione IHC multiplex per lo studio della densità di quattro sottotipi di cellule uNK in campioni endometriali durante la finestra di impianto (WOI). Il protocollo include la preparazione dei campioni, l'ottimizzazione dei marcatori dei sottotipi, l'imaging microscopico e l'analisi dei dati. Questo protocollo di colorazione IHC multiplex offre un'elevata specificità e sensibilità, consentendo il rilevamento simultaneo di diversi sottotipi di cellule uNK, fornendo così ai ricercatori un potente strumento per esplorare le complessità e i meccanismi della regolazione immunitaria durante la gravidanza.

Introduzione

Il primo nato vivo documentato dopo la fecondazione in vitro-trasferimento di embrioni (IVF-ET) è stato riportato nel 1978. Negli ultimi 40 anni, c'è stata una forte domanda di assistenza di FIV-ET tra le coppie sterili¹. Nel 2021, 238.126 pazienti hanno iniziato un totale di 413.776 cicli di fecondazione in vitro negli Stati Uniti. Ciò segna un aumento del 25% dei cicli rispetto a 2 anni prima e un aumento del 135% rispetto al 2012². Questo aumento è principalmente attribuito alla crescente prevalenza dell'infertilità e al ritardo nella pianificazione della gravidanza. I progre....

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca clinica del cluster orientale dell'Università cinese congiunta di Hong Kong-Nuovi Territori (CREC n. rif.: 2022.581). Le donne con RIF sono state reclutate presso l'Assisted Reproductive Technology Center, Prince of Wales Hospital, Chinese University of Hong Kong. La RIF è stata definita come l'incapacità di ottenere una gravidanza clinica dopo il trasferimento di almeno 4 embrioni di buona qualità in un minimo di 3 cicli freschi o congelati in una donna di età inferiore ai 40 anni e¹⁰. Il consenso informato è stato ottenuto dalle partecipanti prima ....

Discussione

L'impianto dell'embrione comporta una complessa interazione tra l'embrione e l'endometrio. Lo stato immunologico dell'omeostasi endometriale gioca un ruolo fondamentale nel determinare la ricettività endometriale. Durante la WOI, la popolazione leucocitaria predominante nell'endometrio è costituita dalle cellule NK. Circa il 90% delle cellule uNK mostra un'elevata espressione di CD56 ma manca di CD16. Tuttavia, un sottogruppo minore di cellule uNK assomiglia alle cellule NK del sangue .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining