מדידה של ארבעה תת-סוגים של תאי NK ברחם באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מרובת משתתפים בנשים עם כישלון השתלה חוזר

Summary

מחקר זה מציג שיטה חלוצית לכימות תת-קבוצות תאי הרג טבעיים ברחם במהלך חלון ההשתלה באמצעות טכניקות מתקדמות של צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מרובה.

Abstract

אימונוהיסטוכימיה (IHC) ממלאת תפקיד מכריע במחקר ביולוגי ובאבחון קליני, ומשמשת כשיטה הנפוצה ביותר לזיהוי והדמיה של אנטיגנים ברקמות. עם זאת, לשיטות צביעה מסורתיות של IHC יש מגבלות בהבחנה בין תת-סוגים שונים של תאי חיסון. אתגר זה הניע מדענים לחקור טכנולוגיות ומתודולוגיות חדשות לזיהוי והתמיינות מדויקים של תת-סוגים של תאי מערכת החיסון. בשנים האחרונות, מולטיפלקס IHC התגלה כפתרון, המאפשר זיהוי בו זמנית של אנטיגנים מרובים והדמיה שלהם בתוך אותה דגימת רקמה. תאי הרג טבעי ברחם (uNK) ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכי הריון מוקדמים, כולל דצידואליזציה, עיצוב מחדש של עורקים ספירליים ברחם והשתלת עוברים. תת-סוגים שונים של תאי uNK מציגים תפקידים שונים, המאפשרים להם לתאם אירועים ביולוגיים שונים להתפתחות מוצלחת של עוברים והריון. לכן, מחקר מעמיק על תת-סוגים של תאי uNK חיוני להבהרת מנגנוני ויסות החיסון במהלך ההריון. מחקרים כאלה מספקים תובנות יקרות ערך וגישות חדשניות לטיפול במצבים קשורים כגון פוריות וכישלון רבייה חוזר. מאמר זה מציג פרוטוקול צביעה IHC מפורט לחקר הצפיפות של ארבעה תת-סוגים של תאי uNK בדגימות רירית הרחם במהלך חלון ההשתלה (WOI). הפרוטוקול כולל הכנת דגימות, אופטימיזציה של סמני תת-סוג, הדמיה מיקרוסקופית וניתוח נתונים. פרוטוקול צביעת IHC מרובה משתתפים זה מציע ספציפיות ורגישות גבוהות, ומאפשר זיהוי סימולטני של תת-סוגים שונים של תאי uNK, ובכך מספק לחוקרים כלי רב עוצמה לחקור את המורכבויות והמנגנונים של ויסות חיסוני במהלך ההריון.

Introduction

לידת החי המתועדת הראשונה לאחר הפריה חוץ גופית והחזרת עוברים (IVF-ET) דווחה בשנת 1978. במהלך 40 השנים האחרונות, יש ביקוש גבוה לסיוע של IVF-ET בקרב זוגות עקרים¹. בשנת 2021, 238,126 מטופלים יזמו בסך הכל 413,776 מחזורי הפריה חוץ גופית בארצות הברית. מדובר בעלייה של 25% במחזורים משנתיים קודמות ועלייה של 135% משנת 2012². זינוק זה מיוחס בעיקר לעלייה בשכיחות של אי פוריות ועיכוב בתכנון ההריון. התקדמות בטכניקות תרבית עוברים ופרוטוקולי סופרביוץ הובילו לשיעור לידות חי מוגבר בכל מחזור חוצן, שהגיע ל -30%-50% בנשים מתחת לגיל 40 ופחות מ -30% בנשים מעל גיל 40^2. עם זאת, למרות התקדמות זו, יותר ממחצית העוברים המועברים עדיין אינם מצליחים להשתרש. כישלון השתלה חוזר (RIF), המוגדר בדרך כלל ככישלון לאחר שלושה ניסיונות רצופים או יותר של החזרת עוברים באיכות גבוהה, משפיע על 15% מהנשים שעוברות הפריה חוץ גופית³. זוגות עם RIF פגיעים מאוד ונוטים יותר לעבור הליכים יקרים ומיותרים שעלולים לחשוף אותם לסיכונים מיותרים⁴. לכן, הבנת הגורמים ל-RIF ושיפור השתלת העוברים היא חיונית לשיפור ההצלחה של הפריה חוץ גופית, במיוחד עבור נשים עם RIF. הכנת רירית הרחם היא קריטית להשתלת עובר מוצלחת. תהליך זה מאופיין בהצטברות משמעותית של תאי הרג טבעי ברחם (uNK), העוברים מהיותם 30% מסך הלימפוציטים ברירית הרחם בשלב ההפרשה האמצעית ל-70%-80% בשלב ההרעה בתחילת ההריון⁵. יש לציין כי תאי uNK שונים מתאי NK היקפיים, שהם לימפוציטים ציטוטוקסיים החיוניים למערכת החיסון המולדת לגרימת מוות של התאים הנגועים באמצעות ליזה או אפופטוזיס. בעוד שהתפקודים המדויקים של תאי uNK עדיין אינם מובנים במלואם, מספר שורות של ראיות מצביעות על כך שהם מעורבים בעיצוב מחדש של אנגיוגנזה, פלישת טרופובלסטים והתפתחות עוברית⁶. הקשר בין אחוז תאי uNK על פני תאי סטרומה לבין RIF זכה למשיכה רבה במהלך 20 השנים האחרונות. מטא-אנליזה עדכנית, שכללה 8 מחקרים שכללו 604 נשים, הראתה כי צפיפות תאי CD56+uNK בשלב האמצע לוטאלי גדלה באופן משמעותי אצל נשים עם RIF בהשוואה לבקרות פוריות⁷. עם זאת, חשוב לציין כי המאפיינים של תאי uNK בשלב האמצעי-לוטאלי שונים באופן משמעותי מאלה של תאי NK נשירים (dNK). למרות שתאי uNK עשויים להתמיין לתת-קבוצות שונות של תאי dNK לאחר הריון, מדידת תאי uNK בלבד אינה מייצגת במדויק תאי dNK⁸. תאי uNK עוברים התמיינות דינמית וממלאים תפקידים שונים במחזור החודשי ובתהליכי הדצידואליזציה, מה שהופך אותם למורכבים יותר ממה שניתן לזהות על ידי CD56 בלבד. סמנים מרובים נדרשים כדי להשיג הבנה מקיפה של התנהגות תאי uNK במהלך הכנת רירית הרחם. המחקר האחרון שלנו השתמש בריצוף RNA חד-תאי כדי לזהות את המגוון של תאי uNK במהלך המחזור החודשי. התוצאות, שאומתו באמצעות ציטומטריית זרימה, הראו נוכחות של ארבעה תת-סוגים שונים של תאי uNK, שכל אחד מהם מציג שינויים דינמיים במהלך המחזור החודשי⁹. ניתוח העשרת גנים והעשרה תפקודית של אונטולוגיה גנטית מצביעים על כך שתת-קבוצות uNK אלה ממלאות תפקידים שונים בשלבים שונים של הווסת. עם זאת, ציטומטריית זרימה אינה נגישה באופן אוניברסלי במעבדות קליניות, והעיבוד המיידי של רקמת רירית הרחם הטרייה לעיכול אנזימים אינו מאפשר לחזור על שלבי ניסוי על גבי טעויות.

מטרת מחקר זה הייתה, אם כן, לחקור את המדידה של ארבע תת-אוכלוסיות אלה של תאי NK באמצעות בדיקת צביעה מרובה, המספקת גישה אבחנתית מעשית יותר. בצביעות מרובות, נוגדנים ספציפיים שונים כנגד כל מטרה מקושרים לתוויות פלואורופור שונות הפולטות אורכי גל שונים של אור כאשר הם מעוררים על ידי אורך גל מסוים של אור. בהשוואה לשיטת הצביעה המסורתית של IHC, שיטה זו יכולה להשוות כמותית את השפע והתפוצה היחסיים של מטרות מרובות במדגם ולספק מידע על אינטראקציה ולוקליזציה משותפת של מטרות שונות, מה שמאפשר לנו לזהות תת-סוגים שונים של תאי uNK. גישה זו לא רק תעמיק את הבנתנו את הקשר בין תאי uNK לבין RIF, אלא גם תספק תובנות לחקר תת-אוכלוסיות אחרות של תאי מערכת החיסון במחלות הקשורות לרירית הרחם.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר הקליני של האוניברסיטה הסינית המשותפת של הונג קונג-הטריטוריות החדשות במזרח (CREC ref no.: 2022.581). נשים עם RIF גויסו מהמרכז לטכנולוגיית רבייה בסיוע, בית החולים פרינס אוף וויילס, האוניברסיטה הסינית של הונג קונג. RIF הוגדר ככישלון להשיג הריון קליני לאחר החזרת לפחות 4 עוברים באיכות טובה במינימום של 3 מחזורים טריים או מוקפאים באישה מתחת לגיל^{40 שנים 10}. הסכמה מדעת התקבלה מהמשתתפים לפני איסוף ביופסיות רירית הרחם.

1. רכישה ועיבוד של דגימות רירית הרחם

1. עיתוי איסוף דגימות רירית הרחם
   1. איסוף דגימות רירית הרחם בהתאם לפרוטוקול קפדני כדי להבטיח עקביות בקרב משתתפי המחקר. עבור חולים עם מחזורים טבעיים, לבצע בדיקת שתן מהיום ה^-9 של המחזור החודשי ולבצע ביופסיה רירית הרחם ביום השביעי לאחר גל LH (LH+7)¹¹ . עבור חולים שעברו מחזורי טיפול הורמונלי חלופי (HRT), יש לתת 6 מ"ג של אסטרדיול ולרט דרך הפה מדי יום החל מהיום השני של המחזור החודשי.
   2. להעריך את עובי רירית הרחם על ידי אולטרה סאונד ביום 13 של המחזור החודשי. כאשר עובי רירית הרחם מגיע או עולה על 8 מ"מ, לנהל פרוגסטרון transvaginally ולבצע ביופסיה רירית הרחם 5 ימים לאחר מתן פרוגסטרון¹².
2. איסוף דגימות רירית הרחם וקיבוע: להכניס דוגם פיפטה לחלל הרחם, לקדם אותו לאזור הקרן; החל יניקה על ידי משיכת הבוכנה הפנימית, בו זמנית לגרד את משטח רירית הרחם באמצעות תנועות סיבוביות ואנכיות בתוך חלל הרחם. שטפו את הדגימות שנאספו במי מלח רגילים כדי לחסל הפרשות צוואר הרחם והרחם. למדוד דגימות ולהעריך את הגודל. עבור דגימות של 3 מ"מ x 15-25 מ"מ, טבלו אותן מיד ב-10 מ"ל של פורמלין חוצץ נייטרלי 10% וקיבעו אותן בטמפרטורת החדר למשך 24-48 שעות.
3. התייבשות: עם השלמת הקיבוע, יש להעביר את הדגימות לרצף התייבשות שנועד להחליף מים באתנול. כדי לעשות זאת, לטבול רקמות 70%, 80%, 90%, ו 100% אתנול אמבטיות כדי להבטיח התייבשות מוחלטת. לאחר אמבט האתנול הסופי, נקו את הדגימות בקסילן כדי להסיר שאריות אלכוהול והכינו אותן לחדירת פרפין.
4. הטבעה: לאחר הנחת הרקמה שטוחה בתחתית התבנית, המיסו פרפין והוסיפו אותו בזהירות לדגימות כדי להבטיח שרקמת רירית הרחם עטופה לחלוטין במטריצת הפרפין. לאחר מילוי התבניות בשעוות פרפין, מצננים אותן על שולחן מקפיא כדי לקדם את התמצקות שעוות הפרפין. לאחר שאבני הפרפין מתקשות, יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד לעיבוד נוסף.
   הערה: התבניות בהן נעשה שימוש נבחרו במיוחד כדי להתאים לגודל דגימות רירית הרחם שהתקבלו כדי לאפשר לרקמת רירית הרחם להשתטח על התחתית ללא קיפול, ובכך להבטיח כיוון אופטימלי לחתך הבא וללא יצירת עודפים מיותרים.
5. חיתוך: כדי להתכונן לחתך, מקררים את קוביות הפרפין ב-4°C למשך שעתיים. פורסים את הדגימות למקטעים של 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום, ולאחר מכן משטחים את הפרוסות על פני המים המזוקקים שחוממו ל-42 מעלות צלזיוס ומרכיבים אותן על מגלשות זכוכית דביקות. הניחו את הפרוסות על מייבש שקופיות למשך הלילה ואחסנו בטמפרטורת החדר לפני השימוש.

2. אופטימיזציה של תנאי אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס

1. אימות IHC: לצורך אימות פרמטרים של צביעת IHC, אמץ גישה שיטתית לכוונון עדין של התנאים לשליפת אנטיגן, ריכוז נוגדנים וזמני דגירה.
   1. במסגרת טווחי הדילול המומלצים של היצרן, יש לבדוק ריכוזים של 2-3 לכל נוגדן. מטב את אחזור האנטיגן על ידי השוואת מאגרים ב- pH 6 ו- pH 9, והערך פרוטוקולי דגירה הן בטמפרטורת החדר למשך 1.5 שעות והן בלילה ב- 4 מעלות צלזיוס.
   2. העריכו כל מצב בקפדנות, תוך התמקדות בעוצמת הצביעה, ספציפיות ורעשי רקע. בחר את השילוב האופטימלי המניב את הצביעה הברורה והספציפית ביותר עם כריכה מינימלית שאינה ספציפית. אימות קפדני זה הבטיח את הדיוק ויכולת השחזור הגבוהים ביותר בפרוטוקול IHC.
2. צביעת מונופלקס של הגברת אות טירמיד (TSA): לאחר קביעת פרמטרי הצביעה האופטימליים עבור נוגדנים בודדים, מטב את זיווג הנוגדנים עם צבעי TSA שונים. התאימו את הסמן בעל הביטוי הגבוה יותר לצבע בעל עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה יותר, או להיפך. במהלך שלב זה, בצע התאמות לריכוז הנוגדנים ולזמן הדגירה בהתאם לעוצמת האות הפלואורסצנטי שנצפה. אם נצפה רקע משמעותי או צביעה לא ספציפית, שנו את הצבע המשויך¹³.
3. צביעת מולטיפלקס TSA: עבור פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה מרובת מרבבים (m-IHC), סדר הצביעה הרציף הוגדר בקפידה על פי עקרונות מבוססים. כדי להבטיח שתהליך הריבוב ישקף את הרגישות והספציפיות של צביעה על תווית יחידה, העדיפו נוגדנים עם רמות ביטוי נמוכות יותר בתחילת רצף הצביעה. מקמו נוגדנים הדורשים תיקון בסיס לשליפת אנטיגן בסוף רצף הצביעה, שכן תיקון הבסיס חזק בהשוואה לשיטות מבוססות חומצה, אשר יכולות, במקרים מסוימים, להגביר חפצי צביעה לא ספציפיים.
4. בעזרת הממצאים משלבים 2.1 ו-2.2, מחליטים על הנוגדנים בהם יש להשתמש ובאיזה שלב, בהתבסס על דרישות שליפת האנטיגן שלהם וצפיפויות הביטוי שלהם. לדוגמה, נוגדן CXCR4, הדורש תיקון בסיס לשליפת אנטיגן, הוצב בשלבים הסופיים של הצביעה. לעומת זאת, נוגדן CD49a, המאופיין בצפיפות ביטוי נמוכה יותר, קיבל את המיקום הראשון ברצף הצביעה. מקסם את הסיכויים לזיהוי מוצלח ומזער את השפעות המיסוך שעלולות להתרחש בשלבים מאוחרים יותר של הליך הריבוב.
5. עבור שאר הנוגדנים, בדוק שילובים שונים במהלך שלב האופטימיזציה כדי לקבוע את הרצף היעיל ביותר המאזן הן רגישות והן ספציפיות. תוצאות ניתוחים השוואתיים אלה ינחו את ההרכב הסופי של לוח המרובב, כמפורט בטבלה 1, ויבטיחו שהחלונית הנבחרת תספק ביצועים מיטביים תוך מזעור הרקע.

3. תהליך m-IHC

1. ניקוי, הידרציה וקיבוע: אפו את חלקי הרקמה בטמפרטורה של 60°C במשך שעתיים, ולאחר מכן טבלו ברצף ב-xylene I (10 דקות), xylene II (10 דקות), 100% אתנול (5 דקות), 95% אתנול (5 דקות), 80% אתנול (5 דקות), 75% אתנול (5 דקות), ddH₂O (2 דקות עבור 3x), 10% פורמלין חוצץ ניטרלי (לפחות 20 דקות), ו ddH₂O (2 דקות עבור 3x).
2. אחזור אנטיגן: הוסף 200 מ"ל של מאגר AR6 או AR9 בהתאמה, כמפורט בטבלה 1 עבור כל נוגדן, לקלטת אחזור אנטיגן עמידה בחום. מניחים את המקטעים במאגר שליפת האנטיגן המתאים ומחממים במיקרוגל בעוצמה גבוהה כ-2 דקות עד לרתיחה. לאחר מכן, מכסים את הקלטת באופן רופף, מחממים על עוצמה נמוכה במשך 15 דקות, ומצננים לטמפרטורת החדר. שטפו את המקטעים עם ddH₂O ו-PBST.
3. ציור מחסום הידרופובי: לאחר הסרת התמיסה העודפת עם נייר סופג, ציירו עיגול שלם סביב הרקמה באמצעות עט מחסום הידרופובי.
4. נטרול פעילות אנזימים אנדוגניים: יש לטפל במקטעים עם 3% מי חמצן ולדגור במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף עם PBST 3x למשך 2 דקות כל אחד.
5. חסימת אתרים לא ספציפיים: לאחר הייבוש בנייר סופג, יש למרוח תמיסת חסימה (1x Antibody Diדלent/Block) ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. דגירה עם נוגדן ראשוני: לאחר הסרת התמיסה החוסמת, יש למרוח 150 μL של הנוגדן הראשוני הראשון, CD49a, על כל שקופית בדילול של 1:1000 בדילול נוגדנים 1x. דגירה כפי שמוטב קודם בסעיף 2. לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות עם PBST 3x למשך 2 דקות כל אחת. לגבי שאר הנוגדנים, ראו טבלה 1 ליחסי דילול ספציפיים.
7. דגירה עם נוגדן משני: לפני החלת הנוגדן המשני, השתמש בנייר סופג כדי להסיר לחות עודפת כדי למנוע דילול של מגיב. יש להוסיף 4-5 טיפות (כ-150 מיקרוליטר) של הנוגדן המשני 1x Anti-Ms + Rb HRP לכל שקופית, ולאחר מכן דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לבצע שלוש שטיפות עם PBST במשך 2 דקות כל אחת לאחר הדגירה.
   הערה: שים לב שהנוגדן המשני 1x Anti-Ms + Rb HRP הוא ספציפי לנוגדנים ראשוניים של ארנב ועכבר.
8. הגברת אות עם צבע TSA: לאחר הסרת לחות עודפת, לדלל את צבע TSA 1:100 במדלל ההגברה. הוסף 150 μL של תמיסת צבע TSA מדוללת זו לכל שקופית. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף עם PBST 3x למשך 2 דקות כל אחד.
9. חזור על שלבים 3.2 ו- 3.5-3.8 עבור הליך TSA באמצעות הנוגדן והצבע המתאימים.
10. צביעת גרעינים: לאחר צביעת הנוגדן האחרון, סלקו פלואורופורים לא קשורים על ידי גלי מיקרו במקטעים ב-200 מ"ל של חיץ AR6 בתוך קסטה עמידה בחום, רותחים למשך 2 דקות, ולאחר מכן חימום בהספק נמוך למשך 15 דקות. יש לקרר את הדגימות לטמפרטורת החדר ולשטוף עם ddH₂O ו-PBST. יש להוסיף 150 μL של תמיסת עבודה DAPI מדוללת ב-PBST (1:10) טיפתית, לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף 2x עם ddH₂O.
11. הרכבה: לאחר שהחלקים מיובשים לחלוטין באוויר באזור חשוך למשך כ-30 דקות, יש למרוח טיפה אחת (כ-30 מיקרוליטר) של התושבת הפלואורסצנטית נגד מרווה ולהניח את הכיסויים.
    הערה: הגן על כל הפעולות מפני אור לאחר היישום הראשון של צבע TSA. תצפית מהירה ולכידת תמונה היו חיוניות לאחר השלמת הצביעה כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.

4. רכישה וניתוח של תמונות

1. זמן חשיפה: צלם תמונות באמצעות מכונת הדמיה שיורשת אורכי גל עירור ופליטה המתאימים לפלואורופורים. בעת קביעת זמני חשיפה, בדוק שקופיות עם מגוון רחב של ביטויי סמן כדי להבטיח דיוק. עבור כל שילוב סמן/מסנן, התמקד ידנית באזורים שונים של השקופית. השתמש בתכונה חשיפה אוטומטית כדי להגדיר את זמן החשיפה.
2. בחרו מסננים בהתאם לצבעי TSA ובדקו שקופיות מרובות כדי לקבוע זמני חשיפה מיטביים לערוץ. החל הגדרות אלה באופן עקבי על כל הרכישות הבאות כדי לשמור על יכולת השוואה לאורך ההדמיה.
3. בחירת אזורי לכידה: כדי להבטיח דגימה בלתי משוחדת על פני חלקי רקמה והכללה עקבית של אפיתל לומינלי בכל שדה מנותח, בחר באופן אקראי את האזור הראשוני לרכישת תמונה, כאשר הקריטריון הקריטי הוא נוכחות גבול האפיתל הלומינלי.
4. לאחר לכידת שדה ראשוני זה, בחר באופן שיטתי את האזורים הבאים על ידי הזזת שדה אחד שמאלה או ימינה מנקודת ההתחלה (השמטת שדה אחד בין כל תמונה שנתפסה) תוך שמירה על גבול האפיתל הלומינלי בתוך המסגרת. חזור על תהליך זה כדי ללכוד לפחות חמישה אזורים שונים, שכל אחד מהם מכיל לפחות חלק מהאפיתל הלומינלי, כדי לשמור על עומק עקבי של ניתוח לאורך¹⁴. גישה זו נועדה לכלול מינימום של כ -10,000 תאי סטרומה בכל השדות שנלכדו כדי להבטיח איסוף נתונים מקיף ומייצג.
5. ניתוח תמונות
   1. הכנת תמונה: כדי לייבא ולנתח תמונות מולטיספקטרליות, נווט תחילה אל File > Open Image בממשק התוכנה כדי לטעון את הקבצים ואת השקופית Autofluorescence (AF). לאחר העלאת התמונות, המשך לערבב את הפלואורופורים על ידי לחיצה על בחר פלואורים כפתור ובחירת הספרייה הספקטרלית המתאימה. לאחר שכל הפלואורופורים נבחרו, לחץ על אישור כדי לאשר את הבחירה. כדי לבודד את ספקטרום המיקוד האוטומטי, השתמש בכלי הטפטפת של המיקוד האוטומטי כדי לדגום אזור מייצג של רקמה מתמונת המיקוד האוטומטי, תוך הקפדה שלא לכלול פיקסלים שאינם רקמות. לאחר הדגימה, לחץ על הכן תמונה או הכן הכל בפינה השמאלית התחתונה של ממשק¹⁵.
   2. פילוח רקמות: התחל את תהליך הסגמנטציה על ידי שרטוט ידני של קו בסיס של 3-5 אזורים לכל סוג רקמה בתמונה, כולל אזורי אפיתל המכילים תאי אפיתל, אזורי סטרומה המכילים תאי סטרומה ואזורים ריקים ללא תוכן תאי. אם תוצאות הפילוח הראשוניות אינן משביעות רצון, הוסף ביאורים ידניים לאזורים נוספים כדי לשפר את מערך נתוני האימון, ובכך להגדיל את הדיוק והאמינות של הניתוחים הבאים. התאמה דינמית זו של אזורים ופרמטרים מבטיחה שהתוכנה תוכל לזהות באופן אוטומטי מבנים דומים בתמונות הנוכחיות ואחרות המיובאות בדיוק רב יותר.
      הערה: הביאור הראשוני משמש כערכת נתוני אימון עבור התוכנה כדי ללמוד את המאפיינים של כל רכיב רקמה. יכולות הפילוח של התוכנה משתכללות באופן איטרטיבי בהתבסס על המורכבות והשונות של הרקמה.
   3. פילוח תאים: לחץ/י על ״פלח תאים ״ כדי להתחיל בפיצול תאים. בהגדרה פילוח תאים, בחר גרעינים וממברנה. בחר DAPI כדי לזהות גרעיני תאים ולהתאים את הגדרת העוצמה כדי לזהות את כל גרעיני התא ללא רעשי רקע. בחר אותות CD16, CD49a ו - CD56 כדי למצוא את הממברנה והשתמש באות זה כדי לסייע בפיצול גרעיני. השתמש בתכונת פיצול הרכיבים הגרעיניים כדי להבחין בין גרעינים הממוקמים קרוב.
      הערה: DAPI מסמן את החלק הפנימי של תאים. תכונת פיצול הרכיבים הגרעיניים מסייעת להבחין בין גרעיני תאים כאשר הם קרובים זה לזה או נראים ממוזגים. שלב זה חשוב לקבלת ספירת תאים אמינה ולשמירה על שלמות הניתוח.
   4. פנוטיפ תאים: אמץ ארבעה סמנים שונים של פני התא כולל CD56, CD49a, CXCR4 ו- CD16 כדי להבדיל בין תת-סוגים שונים של תאי NK. בסכימת הפנוטיפ, תייגו את ארבעת הסמנים הללו כפנוטיפים שיש להמשיך. במקטע Associate View, הקצה צבעים ספציפיים לכל אחד מהפנוטיפים לצורך זיהוי. באמצעות הלחצן 'הוסף', סווג תאים כמבטאים את הסמנים באופן חיובי או שלילי; לדוגמה, בפנוטיפ CD56, תאים יכולים להיות מסומנים כ- CD56+ או CD56-. תייג ידנית לפחות חמישה תאים עבור כל פנוטיפ במהלך תהליך האימון. בצעו תיוג ידני נוסף אם האימון הראשוני אינו מניב תוצאות יעילות.
   5. לאחר הגדרת תצורת הפנוטיפ של התא, כל תא בתמונה יציין אם ארבעת סמני פני השטח מבוטאים באופן חיובי או שלילי. יצא את הנתונים המתקבלים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
   6. עיבוד נתונים: יבא את הנתונים המתקבלים מכל התמונות לגיליון אלקטרוני לצורך עיבוד. חשב אחוזים מכל תת-סוגי תאי uNK ביחס למספר התאים הכולל בתמונה. ספירת התאים הסופית מייצגת את הספירה הממוצעת על פני תמונות מרובות, ומספקת סקירה מקיפה של אוכלוסיית תת-סוגים שונים של תאי uNK בדגימה.

תוצאות

כדי לשמור על עקביות בעיתוי איסוף דגימות רירית הרחם לנשים שעברו את המחזור הטבעי, בוצעה בדיקת שתן כדי לזהות במדויק את נחשול הורמון הלוטיניזציה (LH) שלהן, עם ביופסיות רירית הרחם שנערכו 7 ימים לאחר נחשול LH. עבור נשים שעברו מחזורי HRT, הדגימות נקבעו בדיוק 5 ימים לאחר תחילת תוספת פר...

Discussion

השתלת עובר כרוכה באינטראקציה מורכבת בין העובר לרירית הרחם. המצב החיסוני של הומאוסטזיס רירית הרחם ממלא תפקיד מרכזי בקביעת קליטת רירית הרחם. במהלך WOI, אוכלוסיית הלויקוציטים השלטת ברירית הרחם היא תאי NK. כ -90% מתאי uNK מציגים ביטוי CD56 גבוה אך חסרים CD16. עם זאת, תת-קבוצה מינורית של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primary antibodies
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primary antibodies
CD16	abcam	ab183354	Primary antibodies
CXCR4	R&D	MAB172	Primary antibodies
Amplification diluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Data analysis software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
microwave	Akoya Biosciences	inverter	Microwave stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nucleic acid staining