Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa de la mucosa gástrica para la detección de Helicobacter pylori y la resistencia a los antibióticos

Resumen

Un método rápido y preciso para la detección de H. pylori y las pruebas de resistencia a los medicamentos es muy importante para erradicar eficazmente el H. pylori en la práctica clínica. Este protocolo tiene como objetivo presentar una metodología específica que involucra la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de la mucosa gástrica para la detección rápida de H. pylori y resistencia a antibióticos.

Resumen

Helicobacter pylori es un patógeno principal que infecta a casi la mitad de la población mundial y amenaza la salud pública debido a su creciente resistencia a los antibióticos. Además, Helicobacter pylori también es responsable de gastritis crónica, úlceras gástricas y duodenales, carcinoma gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica (MALT). Por lo tanto, es fundamental realizar un diagnóstico oportuno y preciso de H. pylori y la determinación de su resistencia a los antibióticos. Hoy en día, los métodos existentes para el diagnóstico de H. pylori incluyen principalmente la prueba rápida de ureasa (RUT), la prueba de aliento con urea (UBT), la prueba de anticuerpos séricos, la prueba de antígenos, la gastroscopia y el cultivo bacteriano. Sin embargo, las bacterias no pudieron cultivarse a través de los primeros cinco métodos de detección, por no hablar de la detección de resistencia a los fármacos. El cultivo bacteriano requiere mucho tiempo y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos no se pueden realizar de forma rápida y rutinaria. En entornos clínicos, la identificación rápida y precisa de H. pylori y su susceptibilidad a los antibióticos es crucial para su eliminación efectiva. El objetivo de este protocolo es esbozar un enfoque dirigido que utilice la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en muestras de mucosa gástrica para acelerar el diagnóstico de H. pylori y evaluar su resistencia a los agentes antimicrobianos. La qPCR se aprovechó para detectar el gen ureA para la infección por H. pylori y las mutaciones en los genes 23S rRNA y gyrA asociadas con la resistencia a la claritromicina y las quinolonas, respectivamente. En la actualidad, siguen existiendo desafíos en la qPCR de la mucosa gástrica debido a la falta de procedimientos operativos estándar. Por lo tanto, es esencial compartir metodologías con detalles experimentales para garantizar una comunicación precisa de los procedimientos experimentales, contribuyendo a protocolos de referencia que permitan una mayor transparencia. En general, este protocolo ofrece una alternativa económica y rápida a los métodos convencionales para evaluar la infección por H. pylori y su resistencia a los antibióticos mediante la aplicación de la tecnología cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR).

Introducción

H. pylori es una bacteria gramnegativa que puede sobrevivir en presencia de un nivel bajo de oxígeno. El organismo pertenece a varias poblaciones genéticas distintas y muestra una alta diversidad genética. Aunque el organismo suele tener forma de espiral, se podría cambiar a una varilla¹. Es un patógeno principal que infecta a casi el 50% de la población mundial². En la mayoría de los casos, la infección se produce cuando los pacientes siguen siendo portadores sanos durante la infancia y los síntomas se manifiestan más tarde en la edad adulta. Se ha reportado que es relativo a la gastritis crónica, las úlceras gástricas y duodenales, el carcinoma gástrico y el linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica (MALT)³. Las diferencias en las manifestaciones de la infección por H. pylori podrían deberse a los elementos de patogenicidad de distintas cepas bacterianas, así como a los atributos del huésped y sus patrones dietéticos⁴. La investigación indica que los hombres que fuman y consumen alcohol tienen un mayor riesgo de contraer infecciones por H. pylori ⁵. La eficacia de la eliminación de H. pylori para prevenir el cáncer de estómago y las lesiones precancerosas ha sido verificada en varios estudios ^6,7. Por lo tanto, la erradicación de H. pylori fue aconsejada como medida preventiva por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer de la Organización Mundial de la Salud (OMS)⁸.

El diagnóstico rápido y preciso de la infección por H. pylori es una parte fundamental del tratamiento para la mayoría de las personas que padecen dispepsia asintomática. El diagnóstico de H. pylori implica una combinación de abordajes invasivos y no invasivos. Las técnicas invasivas suelen abarcar la endoscopia para la visualización directa, el análisis histológico de muestras de tejido, la prueba rápida de ureasa (RUT) para detectar la actividad bacteriana y el cultivo de las bacterias. Por otro lado, las estrategias no invasivas comprenden la prueba de aliento con urea (UBT), que mide el metabolismo bacteriano; la prueba de antígeno en heces (SAT), que detecta proteínas bacterianas en las heces; pruebas serológicas que buscan anticuerpos en la sangre; y el diagnóstico molecular que utiliza material genético para la detección. Si bien cada uno de estos métodos de diagnóstico tiene sus propias ventajas e inconvenientes, en el ámbito de la práctica clínica, no existe un único método que sea universalmente reconocido como el punto de referencia definitivo⁹.

Actualmente, el tratamiento primario para las infecciones por H. pylori son los antibióticos. Sin embargo, las tasas de éxito de las terapias antimicrobianas destinadas a erradicar el H. pylori han ido disminuyendo, atribuible a varios factores. Se sospecha que las causas predominantes de ineficacia del tratamiento son la resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos y la adherencia de los pacientes a la pauta prescrita¹⁰. Específicamente, las cepas de H. pylori que son resistentes a la claritromicina han sido objeto de una amplia investigación¹¹. La incidencia de tal resistencia está en aumento en numerosas naciones. La resistencia a H. pylori se debe principalmente a mutaciones en el gen de la región variable del ARNr 23S, que causa cambios conformacionales en el ribosoma. En consecuencia, el sitio de unión para la claritromicina cambia, lo que lleva a una afinidad debilitada entre H. pylori y claritromicina, evitando la inhibición de la síntesis de proteínas bacterianas¹². Se sabe que las mutaciones en las posiciones A2143G, A2142G y A2142C dentro del segmento de 2,9 kb del gen 23S rRNA confieren resistencia a la claritromicina. La propagación de la resistencia a las fluoroquinolonas también ha sido objeto de numerosas investigaciones. Los estudios han documentado tasas de resistencia a levofloxacino del 34,5% en China y del 22,1% en Italia¹³. Los fármacos quinolonas actúan principalmente sobre la topoisomerasa II de H. pylori inhibiendo la actividad enzimática, afectando la síntesis y replicación del ADN y la estructura secundaria, logrando así fines antibacterianos. Si se producen mutaciones en los genes que codifican las subunidades de topoisomerasa, gyrA y gyrB, se impedirá la unión de antibióticos como la levofloxacina y la enzima, lo que resultará en la incapacidad de inhibir la replicación del genoma de H. pylori , causando así resistencia. Entre estos, los puntos calientes de mutaciones en el gen gyrA se concentran en los aminoácidos 87 y 91, mientras que las mutaciones en el gen gyrB ocurren con menos frecuencia y a menudo se acompañan de mutaciones en gyrA¹⁴. Los loci de mutación del gen de resistencia a levofloxacino incluyen principalmente los seis sitios de mutación (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) ubicados en el gen del giroA. La identificación de mecanismos de resistencia derivados de alteraciones genéticas ha provocado una transición progresiva en la detección de H. pylori, alejándose de los métodos basados en cultivos hacia las técnicas de diagnóstico molecular.

La UBT y la SAT son las pruebas no invasivas más elegidas, pero no pueden proporcionar información sobre la susceptibilidad a los medicamentos. En consecuencia, el desarrollo de una técnica rápida y completa para detectar H . pylori y evaluar su resistencia a los medicamentos es crucial para su eliminación efectiva en entornos clínicos¹⁵. Entre las técnicas de detección molecular, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) ha experimentado avances significativos. A diferencia de la PCR estándar, la qPCR elimina la necesidad de electroforesis en gel y permite la cuantificación precisa de ADN o ARN mediante la incorporación de cebadores y sondas específicas durante la fase de recocido. Los kits de qPCR disponibles en el mercado ofrecen ahora la capacidad de identificar las infecciones por H. pylori y la resistencia a los fármacos¹⁶.

Básicamente, existe una necesidad clínica inmediata de un enfoque diagnóstico que sea potente y completo, capaz de detectar infecciones por H. pylori y evaluar la resistencia a los medicamentos al mismo tiempo. Adoptamos el análisis de qPCR de la mucosa gástrica para la detección de H. pylori y la resistencia a los antibióticos utilizando diferentes sondas de cebador.

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Protocolo

El estudio existente se llevó a cabo de conformidad con las consideraciones éticas establecidas por el comité de ética del Hospital Popular Provincial de Guangdong, Universidad Médica del Sur, Guangzhou, China (Número de aprobación: KY2024-1115-01). Se incluyeron pacientes con edades comprendidas entre los 18 y los 60 años. Para este estudio, se excluyó a los participantes que habían tomado recientemente antibióticos, remedios herbales antibacterianos, inhibidores de la bomba de protones (IBP) o antagonistas de los receptores_H2 dentro de las 2 semanas anteriores a la prueba. Además, las personas que se habían sometido a terapia anti-H. pylori en los últimos 3 meses, o aquellas con problemas cardíacos, hepáticos o renales significativos, neuropatía grave o trastornos psiquiátricos no fueron elegibles para participar. Se excluyeron aquellos con contraindicaciones para la exploración gastroscopia, como perforación gastrointestinal, edad avanzada, signos vitales inestables, etc. El estudio tampoco incluyó a mujeres embarazadas o en período de lactancia. El formulario de consentimiento informado de los sujetos incluye principalmente los siguientes contenidos: (1) antecedentes y propósito de la investigación; (2) ¿Quién no es apto para participar en este proyecto de investigación? (3) ¿Cuáles son los requisitos para participar en la investigación? (4) Posibles beneficios de participar en la investigación; (5) Posibles reacciones adversas, riesgos y molestias; (6) Protección de la privacidad; (7) Derechos del sujeto; (8) Declaración del sujeto; (9) Declaración del investigador, etc.

1. Toma de muestras de la mucosa gástrica

1. Preparación de consumibles de muestreo
   1. Prepare el tubo de muestreo que contiene la solución de almacenamiento.
   2. Prepare pinzas de biopsia para gastroscopio.
2. Preparación de objetos de muestreo
   1. Recoja muestras de pacientes con gastritis crónica, úlcera gástrica, úlcera duodenal, cáncer gástrico o pacientes sospechosos. Recoger muestras manteniendo los procedimientos asépticos.
      NOTA: Los especímenes recolectados incluían tejido de la mucosa gástrica de pacientes o pacientes sospechosos.
   2. Confirme el historial de medicamentos.
      1. Asegúrese de que el paciente no tome antibióticos ni bismuto para H . pylori en un plazo de 4 semanas y que no tome ningún inhibidor del ácido en un plazo de 2 semanas.
      2. Solicitar a los pacientes que toman medicamentos anticoagulantes (warfarina, aspirina, clopidogrel, etc.) que dejen de tomar medicamentos durante 5-7 días.
3. Colección de especímenes
   1. Sitio de muestreo
      1. De acuerdo con los requisitos del nuevo sistema de Sydney, tome muestras de biopsia del antro gástrico, la curva grande y pequeña del cuerpo gástrico y la esquina gástrica (un total de 5 puntos). Los sitios específicos se muestran en la Figura 1. Una pequeña curva del seno pilórico a 2-3 cm del anillo pilórico (A₁) y una gran curva (A₂); a 4 cm del estómago (B₁) y una gran curva a 8 cm del cardias (B₂); esquina gástrica (IA).
      2. De acuerdo con el Consenso de Expertos sobre la Estandarización de la Biopsia Endoscópica Digestiva y el Examen Patológico en China (Borrador), tome muestras de biopsia del lado pequeño del seno gástrico a 5 cm del píloro (adyacente a la esquina gástrica) o del lado grande de la esquina gástrica (biopsia 1-2 piezas).
   2. Descripción del lugar de recogida de muestras especiales
      1. Para los pacientes bajo cualquier tratamiento, después de una retirada durante 4 semanas, recoja muestras de antro gástrico y cuerpo gástrico simultáneamente.
      2. En el caso de los pacientes con cáncer gástrico, se recolecta tejido de la curvatura grande del estómago, pero no del tejido tumoral.
      3. Para los pacientes con úlceras gástricas, recoja el antro gástrico y el tejido del borde de la úlcera gástrica. No recoja la parte inferior de la úlcera.
      4. Para pacientes con gastritis atrófica, recoja el antro gástrico y el cuerpo gástrico. No recoja muestras de áreas de atrofia de la mucosa gástrica y metaplasia intestinal.
   3. Pasos de muestreo
      1. Abra la válvula de pinza para biopsia y muévala lentamente hacia la mano dominante. Cuando la cabeza de las pinzas esté en el campo de visión, abra la solapa de pinza y manipule el endoscopio en la mucosa gástrica del sitio de muestreo.
      2. Aplique una ligera presión, cierre las pinzas de biopsia y pinza el tejido de la mucosa gástrica (diámetro: 0,5-1 mm, aproximadamente 5-10 mg/bloque). Extraiga las muestras de tejido con los alicates en el tubo de muestreo (incluido el líquido de conservación) para completar el sitio.
      3. Continúe completando el muestreo de otros sitios y colóquelos en el mismo tubo de muestreo (incluida la solución de conservación).
      4. Complete el muestreo de todos los sitios, apriete la tapa del tubo de muestreo y selle para evitar que se seque. Etiquete los tubos con un número de identificación único en el exterior.
      5. Envíe las muestras recolectadas para su análisis lo antes posible. No coloque las muestras a temperatura ambiente (RT) durante más de 24 h. Evite la congelación y descongelación repetida de muestras clínicas durante el transporte a larga distancia. Si no se puede garantizar una temperatura de -20 ± 5 °C, transpórtelos a 0-8 °C. Almacene las muestras durante un período de cinco meses a -20 ± 5 °C y, para su almacenamiento a largo plazo, manténgalas por debajo de -70 °C.
   4. Precauciones
      1. Al tomar la muestra, presione las pinzas de biopsia lo más profundo posible para llegar a toda la capa de mucosa.
      2. Al retirar las pinzas de biopsia y abrir la biopsia, sea cuidadoso para evitar desgarros de la mucosa.

2. Extracción de ácidos nucleicos

1. Ajuste la temperatura del baño de metal a 100 °C con anticipación; si la muestra está congelada, retírela y restáurela a RT.
2. Mezclar bien el lisado para suspender la resina de ácido iminodiacético. Tome 100 μL de lisado en el tubo centrífugo con el elemento filtrante, o agregue directamente el tejido de la mucosa gástrica en el tubo de centrífuga con 200 μL de lisado y mezcle con la oscilación del vórtice.
3. Coloque el tubo de centrífuga en un baño de metal a 100 °C durante 10 minutos, luego retírelo y enfríelo a RT.
4. Centrifugar a 9500 g durante 5-10 min. Introduzca con cuidado el sobrenadante en otro tubo de centrífuga esterilizado y márquelo.
5. Realice inmediatamente el siguiente experimento o guárdelo temporalmente a 4 °C para su inspección.

3. Detección por qPCR de H. pylori y genes de resistencia a fármacos (claritromicina y quinolonas)

1. Retire la sonda de cebado, la solución enzimática mezclada y el tampón de detección del kit. Derretir todos los componentes en hielo o 2-8 °C, y mezclarlos con una ligera agitación y centrifugación instantánea a baja velocidad.
2. Mezclar 12,5 μL de tampón de detección + 7,0 μL de sonda de cebador + 0,5 μL de solución enzimática. Calcule primero la cantidad de cada reactivo, agréguelo al tubo de centrífuga de volumen apropiado, mezcle bien y centrifugue brevemente.
   NOTA: La cantidad total de la solución de reacción de PCR debe calcularse incluyendo el número de muestras de prueba, un control positivo fuerte, un control positivo débil, un control negativo y un control negativo de PCR.
3. Una vez configurada la solución de reacción de PCR, agregue 20,0 μL de la solución de reacción de PCR a cada pocillo de reacción de PCR. A continuación, añada 5,0 μL de ácido nucleico al pocillo de reacción de PCR con la solución de reacción de PCR. No agregue ninguna muestra o ácido nucleico al pocillo de control negativo de PCR.
4. Coloque el tubo de reacción en el termociclador fluorescente de PCR y configure los parámetros del ciclo de la siguiente manera: primero, caliente la mezcla de reacción a 42 °C y 95 °C durante 2 min; en segundo lugar, desnaturalizar durante 10 s a 95 °C, recocer y prolongar durante 45 s a 58 °C, repetir durante 40 ciclos.
5. Recopile las señales de fluorescencia como FAM (mutación del gen 23S rRNA), HEX/VIC (mutación del gen gyrA ), ROX (H. pylori) y CY5 (estándar interno) y los datos a 58 °C.
6. Después de la reacción, guarde los datos y analícelos utilizando un software específico de qPCR.

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Resultados

Evaluación de la infección por H. pylori y la resistencia a los antibióticos en el tejido gástrico mediante qPCR
Los ensayos de qPCR para identificar H. pylori se llevaron a cabo dirigiéndose al gen ureA , y la resistencia a los antibióticos se determinó mediante el examen de mutaciones específicas en los genes 23S rRNA y gyrA (Tabla 1). Los datos de aseguramiento de la cal...

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Discusión

Para la detección de H. pylori se utilizan las pruebas tradicionales como RUT, UBT, histología, cultivo y serología. Cada enfoque diagnóstico ofrece ventajas distintas y se enfrenta a desafíos específicos según el contexto clínico¹⁷. El cultivo de H. pylori a partir de biopsias de mucosa gástrica a menudo se considera el punto de referencia para el diagnóstico. No obstante, este método requiere mucha mano de obra y su precisión se ve ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Incubator	ALLSHENG	MK2000-2	Provide a constant temperature environment
Biosafety cabinet	Haier	HR1500-B2
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	THERMO ST16R	Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
Chelex-100	sigma	C7901	Resin
Gastroscope biopsy forceps	Boston Scientific Corporation		Sampling of the gastric mucosa
Helicobacter pylori 23S rRNA gene and gyrA gene mutation detection kit	Jiangsu Mole Bioscience	CFDA 20223400137	qPCR detection kit for H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Nucleic acid extraction reagent	Jiangsu Mole Bioscience	SEDA 20150076	For DNA extraction
SDS Software	Applied Biosystems	7300/7500	Data analysis
Thermocylcer	Thermo Fisher Scientific	ABI 7500	For qPCR detection of H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Vortex mixer	JOANLAB	VM-5005	For mixing reagent