헬리코박터 파일로리균 및 항생제 내성 검출을 위한 위 점막 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석

요약

헬리코박터 파일로리균 검출 및 약물 내성 검사를 위한 빠르고 정확한 방법은 임상 실습에서 헬리코박터 파일로리균을 효율적으로 박멸하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 H. pylori 및 항생제 내성의 신속한 검출을 위해 위 점막 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)과 관련된 특정 방법론을 제시하는 것을 목표로 합니다.

초록

헬리코박터 파일로리는 전 세계 인구의 거의 절반을 감염시키는 주요 병원체이며 항생제 내성이 증가하여 공중 보건을 위협하고 있습니다. 또한 헬리코박터 파일로리는 만성 위염, 위 및 십이지장 궤양, 위암, 위 점막 관련 림프 조직(MALT) 림프종의 원인이 됩니다. 따라서 H. pylori에 대한 시기적절하고 정확한 진단과 항생제 내성 측정을 수행하는 것이 필수적입니다. 현재 H. pylori 진단의 기존 방법은 주로 신속 우레아제 검사(RUT), 요소 호흡 검사(UBT), 혈청 항체 검사, 항원 검사, 위내시경 검사, 세균 배양 등이 있습니다. 그러나 약물 내성 검출은 말할 것도 없고 처음 5가지 검출 방법을 통해 박테리아를 배양할 수 없었습니다. 박테리아 배양은 시간이 많이 걸리며 항생제 감수성 검사는 신속하고 일상적으로 수행할 수 없습니다. 임상 환경에서 H. pylori의 신속하고 정확한 식별과 항생제에 대한 감수성은 효과적인 제거에 매우 중요합니다. 이 프로토콜의 목적은 위 점막 샘플에 대한 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 활용하여 H. pylori의 진단을 신속하게 진행하고 항균제에 대한 내성을 평가하는 표적 접근 방식을 설명하는 것입니다. qPCR은 클라리스로마이신 및 퀴놀론에 대한 내성과 각각 관련된 23S rRNA 및 gyrA 유전자에서 H. pylori 감염에 대한 ureA 유전자 및 돌연변이를 검출하기 위해 개발되었습니다. 현재 위 점막 qPCR은 표준 운영 절차가 없기 때문에 여전히 문제가 있습니다. 따라서 실험 절차의 정확한 전달을 보장하기 위해 실험 세부 사항과 방법론을 공유하는 것이 필수적이며, 이를 통해 투명성을 높일 수 있는 황금 표준 프로토콜에 기여할 수 있습니다. 전반적으로 이 프로토콜은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기술의 적용을 통해 H.pylori 감염 및 항생제에 대한 내성을 평가하는 기존 방법에 대한 경제적이고 신속한 대안을 제공합니다.

서문

H. pylori는 낮은 산소 수치가 있는 곳에서 생존할 수 있는 그람 음성 박테리아입니다. 이 유기체는 여러 개의 뚜렷한 유전적 집단에 속하며 높은 유전적 다양성을 보여줍니다. 유기체는 일반적으로 나선형 모양이지만 막대¹로 변경 될 수 있습니다. 전 세계 인구의 거의 50%를 감염시키는 주요 병원체입니다². 대부분의 감염은 환자가 어린 시절에 건강한 보인자로 남아 있을 때 발생하며, 나중에 성인이 되어서도 증상이 나타납니다. 이 질환은 만성 위염, 위 및 십이지장 궤양, 위암, 위 점막 관련 림프 조직(MALT) 림프종과 관련이 있는 것으로 보고되었다³. 헬리코박터 파일로리균 감염의 발현 차이는 별개의 박테리아 균주의 병원성 요소뿐만 아니라 숙주의 특성과 식이 패턴에 기인할 수 있다⁴. 연구에 따르면 흡연과 음주를 하는 남성은 헬리코박터 파일로리 감염에 걸릴 위험이 더 높다고 합니다⁵. 위암과 전암성 병변을 예방하기 위한 헬리코박터 파일로리균 제거의 효능은 여러 연구에서 입증되었다 ^6,7. 따라서 세계보건기구(WHO) 국제암연구소(International Agency for Research on Cancer)는 헬리코박터 파일로리균 박멸을 예방책으로 권고했다⁸.

헬리코박터 파일로리 감염의 빠르고 정확한 진단은 무증상 소화불량을 앓고 있는 대부분의 개인을 치료하는 데 중요한 부분입니다. 헬리코박터 파일로리균의 진단에는 침습적 접근법과 비침습적 접근법의 조합이 포함됩니다. 침습적 기법에는 일반적으로 직접 시각화를 위한 내시경 검사, 조직 샘플의 조직학적 분석, 박테리아 활동을 감지하기 위한 신속 우레아제 검사(RUT) 및 박테리아 배양이 포함됩니다. 반면에, 비침습적 전략은 박테리아 대사를 측정하는 요소 호흡 검사(UBT)로 구성됩니다. 대변에서 박테리아 단백질을 검출하는 대변 항원 검사(SAT); 혈액에서 항체를 찾는 혈청학적 검사; 탐지를 위해 유전 물질을 사용하는 분자 진단. 이러한 진단 방법에는 각각 고유한 장점과 단점이 있지만, 임상 실습 영역에서 궁극적인 벤치마크로 보편적으로 인정되는 단일 방법은 없습니다⁹.

현재 헬리코박터 파일로리 감염의 주요 치료법은 항생제입니다. 그러나 헬리코박터 파일로리 균 박멸을 목표로 하는 항균 요법의 성공률은 다양한 요인에 기인하여 감소하고 있습니다. 치료 효과가 없는 주된 원인은 항생제에 대한 박테리아의 저항력과 환자가 처방된 요법을 순응하는 것으로 의심된다¹⁰. 특히, 클라리스로마이신(clarithromycin)에 내성이 있는 헬리코박터 파일로리균(H. pylori ) 균주는 광범위한 연구의 대상이었다¹¹. 그러한 저항의 발생률은 많은 나라에서 증가하고 있다. H. pylori 내성은 주로 23S rRNA의 가변 영역 유전자의 돌연변이에 기인하며, 이는 리보솜의 구조적 변화를 유발합니다. 결과적으로, clarithromycin의 결합 부위가 변화하여 H. pylori 와 clarithromycin 사이의 친화력이 약화되어 박테리아 단백질 합성의 억제를 방해합니다¹². 23S rRNA 유전자의 2.9kb 세그먼트 내 A2143G, A2142G 및 A2142C 위치의 돌연변이는 clarithromycin에 대한 내성을 부여하는 것으로 알려져 있습니다. 플루오로퀴놀론에 대한 내성의 확산도 수많은 연구의 초점이 되어 왔습니다. 연구에 따르면 레보플록사신에 대한 내성률은 중국에서 34.5%, 이탈리아에서 22.1%로 기록되었다¹³. 퀴놀론 약물은 주로 H. pylori의 토포이소머라제 II에 작용하여 효소 활성을 억제하고 DNA 합성 및 복제 및 2차 구조에 영향을 미쳐 항균 목적을 달성합니다. 토포이소머라제 소단위체, gyrA 및 gyrB를 암호화하는 유전자에서 돌연변이가 발생하면 레보플록사신과 같은 항생제와 효소의 결합을 방해하여 H. pylori 게놈의 복제를 억제할 수 없게 되어 내성이 발생합니다. 이 중 gyrA 유전자의 돌연변이의 핫스팟은 아미노산 87 및 91에 집중되어 있는 반면, gyrB 유전자의 돌연변이는 덜 자주 발생하고 종종 gyrA¹⁴의 돌연변이를 동반합니다. 레보플록사신 내성 유전자의 돌연변이 자리는 주로 gyrA 유전자에 위치한 6개의 돌연변이 부위(A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G)를 포함합니다. 유전적 변형에서 비롯된 내성 메커니즘의 확인은 H. pylori 검출의 점진적인 전환을 촉발하여 배양 기반 방법에서 분자 진단 기술로 이동했습니다.

UBT와 SAT는 가장 일반적으로 선택되는 비침습적 검사이지만 약물 감수성 정보를 제공할 수 없습니다. 결과적으로, 헬리코박터 파일로리 균을 검출하고 약물에 대한 내성을 평가하기 위한 신속하고 포괄적인 기법의 개발은 임상 환경에서 헬리코박터 파일로리균을 효과적으로 제거하는 데 매우 중요하다¹⁵. 분자 검출 기법 중 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)은 상당한 발전을 이루었습니다. 표준 PCR과 달리 qPCR은 겔 전기영동이 필요하지 않으며 어닐링 단계에서 특정 프라이머와 프로브를 통합하여 DNA 또는 RNA의 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 현재 시판되고 있는 qPCR 키트는 헬리코박터 파일로리 감염 및 약물에 대한 내성을 식별할 수 있는 기능을 제공합니다¹⁶.

기본적으로, 헬리코박터 파일로리 감염을 검출하고 약물 내성을 동시에 평가할 수 있는 강력하고 포괄적인 진단 접근법에 대한 즉각적인 임상적 필요성이 있습니다. 우리는 다양한 프라이머 프로브를 사용하여 H. pylori 검출 및 항생제 내성을 위해 위 점막 qPCR 분석을 채택했습니다.

프로토콜

본 연구는 중국 광저우시 남방의과대학 광동성 인민병원 윤리위원회가 수립한 윤리적 고찰에 따라 진행되었다(승인번호: KY2024-1115-01). 18세에서 60세 사이의 환자가 이 연구에 등록되었습니다. 이 연구에서 참가자는 테스트 전 2주 이내에 최근에 항생제, 항균 약초 요법, 양성자 펌프 억제제(PPI) 또는 H₂ 수용체 길항제를 복용한 경우 제외되었습니다. 또한, 지난 3개월 이내에 항-H. 파일로리 요법을 받은 사람 또는 심각한 심장, 간 또는 신장 문제, 심각한 신경병증 또는 정신 질환이 있는 사람은 참여 대상이 아니었습니다. 위장관 천공, 고령, 불안정한 활력 징후 등과 같은 위내시경 검사에 대한 금기 사항이 있는 사람은 제외되었습니다. 이 연구는 또한 임산부나 모유 수유 중인 여성을 포함하지 않았다. 피험자의 사전 동의서에는 주로 다음과 같은 내용이 포함됩니다: (1) 연구 배경 및 목적; (2) 이 연구 프로젝트에 참여하기에 부적합한 사람은 누구입니까? (3) 연구 참여를 위한 요건은 무엇입니까? (4) 연구 참여의 가능한 이점 (5) 가능한 부작용, 위험 및 불편함; (6) 개인 정보 보호; (7) 주체의 권리; (8) 주체 선언; (9) 연구자 진술서 등

1. 위 점막의 샘플링

1. 샘플링 소모품 준비
   1. 저장 용액이 들어 있는 샘플링 튜브를 준비합니다.
   2. 위내시경 생검 겸자를 준비합니다.
2. 샘플링 개체 준비
   1. 만성 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위암 환자 또는 의심되는 환자로부터 검체를 수집합니다. 무균 절차를 유지하면서 샘플을 수집합니다.
      참고: 수집된 검체에는 환자 또는 의심 환자의 위 점막 조직이 포함되어 있습니다.
   2. 약물 이력을 확인합니다.
      1. 환자는 4주 이내에 H. pylori 에 대한 항생제와 비스무트를 복용하지 않고 2주 이내에 위산 억제제를 복용하지 않도록 합니다.
      2. 항응고제(와파린, 아스피린, 클로피도그렐 등)를 복용 중인 환자에게 5-7일 동안 약물 복용을 중단하도록 요청하십시오.
3. 표본 수집
   1. 샘플링 사이트
      1. 새로운 시드니 시스템의 요구 사항에 따라 위 전방, 위체의 크고 작은 굴곡 및 위 모서리(총 5점)에서 생검 샘플을 채취합니다. 구체적인 사이트는 그림 1에 나와 있습니다. 유문 고리에서 2-3cm 떨어진 유문 동(A₁) 및 큰 굴곡(A₂); 위(B₁)에서 4cm, 심장(B₂)에서 8cm의 큰 굴곡; 위 코너(IA).
      2. Expert Consensus on the Standardization of Digestive Endoscopic Biopsy and Pathological Examination in China(초안)에 따르면, 유문에서 5cm 떨어진 위동(위 모서리에 인접) 또는 위 구석의 큰 쪽(생검 1-2개)에서 생검 샘플을 채취합니다.
   2. 특별 샘플의 수집 위치에 대한 설명
      1. 모든 치료를 받고 있는 환자의 경우, 4주 동안 중단한 후 위전과 위체 샘플을 동시에 채취합니다.
      2. 위암 환자의 경우, 종양 조직이 아닌 위의 큰 곡률에서 조직을 채취해야 합니다.
      3. 위궤양이 있는 환자의 경우 위궤양과 위궤양 가장자리 조직을 채취합니다. 궤양의 바닥을 모으지 마십시오.
      4. 위축성 위염 환자의 경우 위 전방과 위체를 채취합니다. 위 점막 위축 및 장 화생 부위에서 샘플을 수집하지 마십시오.
   3. 샘플링 단계
      1. 생검 클램프 밸브를 열고 주로 사용하는 손으로 천천히 움직입니다. 겸자의 머리가 시야에 있을 때 클램프 플랩을 열고 샘플링 부위의 위 점막에서 내시경을 조작합니다.
      2. 약간의 압력을 가하고 생검 겸자를 닫고 위 점막 조직(직경: 0.5-1mm, 약 5-10mg/블록)을 고정합니다. 샘플링 튜브(보존 유체 포함)의 플라이어로 조직 샘플을 추출하여 사이트를 완성합니다.
      3. 계속해서 다른 사이트의 샘플링을 완료하고 동일한 샘플링 튜브(보존 용액 포함)에 넣습니다.
      4. 모든 사이트의 샘플링을 완료하고 샘플링 튜브 덮개를 조이고 건조를 방지하기 위해 밀봉합니다. 튜브 외부에 고유 식별 번호를 표시하십시오.
      5. 수집된 샘플을 가능한 한 빨리 테스트를 위해 제출하십시오. 샘플을 실온(RT)에서 24시간 이상 두지 마십시오. 장거리 운송 중 임상 표본의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오. -20 ± 5 °C의 온도를 보장할 수 없는 경우 0-8 °C에서 운송하십시오. 샘플을 -20 ± 5 °C에서 5개월 동안 보관하고 장기 보관을 위해 -70 °C 이하로 보관하십시오.
   4. 예방 조치
      1. 샘플링할 때 생검 겸자를 가능한 한 깊게 눌러 점막의 전체 층에 도달합니다.
      2. 생검 겸자를 제거하고 생검을 열 때 점막 파열을 방지하기 위해 부드럽게 주의하십시오.

2. 핵산 추출

1. 금속 수조의 온도를 미리 100°C로 조정하십시오. 샘플이 얼어 있으면 제거하고 RT로 복원하십시오.
2. 용해물을 잘 혼합하여 이미노디아세트산 수지를 현탁시킵니다. 필터 엘리먼트를 사용하여 100μL의 용해물을 원심 튜브에 넣거나 200μL의 용해액과 함께 위 점막 조직을 원심 분리 튜브에 직접 추가하고 와류 진동과 혼합합니다.
3. 원심분리기 튜브를 100°C의 금속 수조에 10분 동안 넣은 다음 제거하고 RT로 식힙니다.
4. 9500g에서 5-10 분 동안 원심분리기 상층액을 다른 멸균된 원심분리기 튜브에 조심스럽게 끌어 넣고 표시합니다.
5. 즉시 다음 실험을 수행하거나 검사를 위해 4°C에서 임시 보관하십시오.

3. H. pylori 및 약물 내성 유전자(clarithromycin 및 quinolone)의 qPCR 검출

1. 키트에서 프라이머 프로브, 혼합 효소 용액 및 검출 버퍼를 제거합니다. 모든 구성 요소를 얼음 또는 2-8 °C에서 녹이고 저속으로 약간의 흔들림과 순간 원심 분리로 혼합합니다.
2. 12.5 μL의 검출 버퍼 + 7.0 μL의 프라이머 프로브 + 0.5 μL의 효소 용액을 혼합합니다. 먼저 각 시약의 양을 계산하고 적절한 부피의 원심분리기 튜브에 넣고 잘 섞은 다음 간단히 원심분리합니다.
   참고: PCR 반응 용액의 총량은 테스트 샘플의 수, 하나의 강한 양성 대조군, 하나의 약한 양성 대조군, 하나의 음성 대조군 및 하나의 PCR 음성 대조군을 포함하여 계산해야 합니다.
3. PCR 반응액을 구성한 후, 각 PCR 반응 웰에 PCR 반응액 20.0 μL를 첨가한다. 그런 다음, PCR 반응 용액으로 PCR 반응 웰에 5.0 μL의 핵산을 첨가한다. PCR 음성 대조군 웰에 샘플이나 핵산을 추가하지 마십시오.
4. 반응 튜브를 형광 PCR 열순환기에 넣고 다음과 같이 사이클 매개변수를 설정합니다.먼저 반응 혼합물을 42°C 및 95°C에서 2분 동안 가열합니다. 둘째, 95 °C에서 10 초 동안 변성, 어닐링 및 58 °C에서 45 초 동안 연장하고 40 사이클 동안 반복합니다.
5. 58°C에서 FAM(23S rRNA 유전자 돌연변이), HEX/VIC(gyrA 유전자 돌연변이), ROX(H. pylori) 및 CY5(내부 표준물질)로 형광 신호를 수집합니다.
6. 반응 후 데이터를 저장하고 특정 qPCR 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

결과

qPCR을 통한 위 조직의 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성 평가
H. pylori를 확인하기 위한 qPCR 분석은 ureA 유전자를 표적으로 하여 수행했으며, 항생제 내성은 23S rRNA 및 gyrA 유전자의 특정 돌연변이를 검사하여 확인했습니다(표 1). 세 그룹 모두에서 CT 값으로 표시되는 품질 보증 데이터?...

토론

RUT, UBT, 조직학, 배양 및 혈청학과 같은 전통적인 검사는 H. pylori 의 검출을 위해 활용됩니다. 각 진단적 접근법은 뚜렷한 이점을 제공하며 임상적 맥락에 따라 특정 문제에 직면해 있다¹⁷. 위 점막 생검에서 H. pylori 를 배양하는 것은 종종 진단의 기준으로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 노동 집약적이며 기술적 문제, 배양에 필요?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Incubator	ALLSHENG	MK2000-2	Provide a constant temperature environment
Biosafety cabinet	Haier	HR1500-B2
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	THERMO ST16R	Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
Chelex-100	sigma	C7901	Resin
Gastroscope biopsy forceps	Boston Scientific Corporation		Sampling of the gastric mucosa
Helicobacter pylori 23S rRNA gene and gyrA gene mutation detection kit	Jiangsu Mole Bioscience	CFDA 20223400137	qPCR detection kit for H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Nucleic acid extraction reagent	Jiangsu Mole Bioscience	SEDA 20150076	For DNA extraction
SDS Software	Applied Biosystems	7300/7500	Data analysis
Thermocylcer	Thermo Fisher Scientific	ABI 7500	For qPCR detection of H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Vortex mixer	JOANLAB	VM-5005	For mixing reagent