ヘリコバクター・ピロリおよび抗生物質耐性を検出するための胃粘膜定量的ポリメラーゼ連鎖反応解析

要約

ピロリ菌の検出と薬剤耐性試験のための迅速かつ正確な方法は、臨床診療で効率的にピロリ菌を根絶するために非常に重要です。このプロトコルは、ピロリ菌と抗生物質耐性の迅速な検出のための胃粘膜定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を含む特定の方法論を提示することを目的としています。

要約

ヘリコバクター・ピロリは、世界人口の約半数が感染する主要な病原体であり、抗生物質耐性の増加により公衆衛生を脅かしています。また、ヘリコバクター・ピロリは、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫の原因にもなります。したがって、ピロリ菌のタイムリーで正確な診断と、その抗生物質耐性の決定を行うことが不可欠です。現在、ピロリ菌の診断法としては、主に迅速ウレアーゼ検査(RUT)、尿素呼気検査(UBT)、血清抗体検査、抗原検査、胃内視鏡検査、細菌培養などの治療法が主流となっています。しかし、最初の5つの検出方法では細菌を培養することはできず、薬剤耐性の検出は言うまでもありませんでした。細菌の培養には時間がかかり、抗生物質感受性試験を迅速かつ日常的に実施することはできません。臨床現場では、ピロリ菌とその抗生物質に対する感受性を迅速かつ正確に同定することが、その効果的な除去に不可欠です。このプロトコルの目的は、胃粘膜サンプルに対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を利用して、ピロリ菌の診断を迅速化し、抗菌剤に対する耐性を評価するための標的アプローチを概説することです。qPCRは、ピロリ菌感染の尿素A遺伝子と、クラリスロマイシンとキノロンに対する耐性に関連する23S rRNAおよびgyrA遺伝子の変異を検出するために利用されました。現在、胃粘膜qPCRには、標準的な操作手順がないため、課題が残っています。したがって、実験手順の正確な伝達を確保するためには、実験の詳細と方法論を共有することが不可欠であり、透明性を高めるゴールドスタンダードプロトコルに貢献します。全体として、このプロトコルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)技術の適用により、H.ピロリ菌感染とその抗生物質に対する耐性を評価するための従来の方法に代わる経済的で迅速な代替手段を提供します。

概要

ピロリ菌は、低酸素レベルの存在下でも生存できるグラム陰性菌です。この生物はいくつかの異なる遺伝的集団に属し、高い遺伝的多様性を示しています。通常、生物はらせん状であるが、ロッド¹に変更することもできる。これは、世界人口の約50%が感染する主要な病原体^です2。ほとんどの場合、感染は、患者が小児期に健康な保因者であり続け、成人期の後半に症状が現れるときに発生します。慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、胃癌、および胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫³に関連していることが報告されています。ピロリ菌感染の症状の違いは、異なる細菌株の病原性要素、宿主の属性、およびそれらの食事パターンから生じる可能性があります⁴。この研究は、喫煙や飲酒に従事する男性は、ピロリ菌感染症にかかるリスクが高いことを示しています⁵。胃がんおよび前がん病変を予防するためのピロリ菌の排除の有効性は、いくつかの研究で確認されています^6,7。そのため、ピロリ菌の除菌は、世界保健機関(WHO)の国際がん研究機関から予防策として勧告されました⁸。

ピロリ菌感染症の迅速かつ正確な診断は、無症候性消化不良に苦しむほとんどの個人にとって治療の重要な部分です。ピロリ菌の診断には、侵襲的アプローチと非侵襲的アプローチの両方の組み合わせが含まれます。侵襲的手法には、通常、直接視覚化するための内視鏡検査、組織サンプルの組織学的分析、細菌活性を検出するための迅速ウレアーゼ試験(RUT)、および細菌の培養が含まれます。一方、非侵襲的戦略には、細菌の代謝を測定する尿素呼気テスト(UBT)が含まれます。糞便中の細菌タンパク質を検出する便抗原検査(SAT)。血液中の抗体を探す血清学的検査。そして、遺伝物質を検出に使用する分子診断。これらの診断方法にはそれぞれ長所と短所がありますが、臨床診療の領域では、究極のベンチマークとして広く認められている単一の方法はありません⁹。

現在、ピロリ菌感染症の主な治療法は抗生物質です。しかし、ピロリ菌の除菌を目的とした抗菌薬の成功率は、さまざまな要因により低下傾向にあります。治療効果がない主な原因は、抗菌剤に対する細菌の耐性と、処方されたレジメン¹⁰への患者のアドヒアランスであると疑われています。具体的には、クラリスロマイシンに耐性を持つピロリ菌の株が広範な研究の対象となっています¹¹。このような抵抗の発生率は、多くの国で増加しています。ピロリ菌耐性は、主に23S rRNAの可変領域遺伝子の変異によるもので、リボソームのコンフォメーション変化を引き起こします。その結果、クラリスロマイシンの結合部位が変化し、ピロリ菌とクラリスロマイシンとの間の親和性が弱まり、細菌タンパク質合成の阻害が妨げられる¹²。23S rRNA遺伝子の2.9 kbセグメント内のA2143G、A2142G、およびA2142Cの位置の変異は、クラリスロマイシンに対する耐性を付与することが知られている。フルオロキノロンに対する耐性の広がりも、多くの調査の焦点となっています。研究によると、レボフロキサシンに対する耐性率は中国で34.5%、イタリアでは22.1%であることが実証^{されています13}。キノロン系薬剤は、主にピロリ菌のトポイソメラーゼIIに作用し、酵素活性を阻害し、DNAの合成と複製、二次構造に影響を与え、抗菌目的を達成します。トポイソメラーゼサブユニットであるgyrA、gyrBをコードする遺伝子に突然変異が生じると、レボフロキサシンなどの抗生物質と酵素の結合が妨げられ、その結果、ピロリ菌のゲノムの複製を阻害できなくなり、耐性が生じます。これらのうち、gyrA遺伝子の突然変異のホットスポットはアミノ酸87および91に集中しているが、gyrB遺伝子の突然変異はそれほど頻繁には発生せず、しばしばgyrA14の突然変異を伴っている。レボフロキサシン耐性遺伝子の突然変異遺伝子座には、主にgyrA遺伝子に位置する6つの突然変異部位(A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G)が含まれます。遺伝的変化に起因する耐性メカニズムの同定により、ピロリ菌の検出は徐々に移行し、培養ベースの方法から分子診断技術へと移行しています。

UBTとSATは、最も一般的に選択される非侵襲的検査ですが、薬剤感受性情報を提供することはできません。したがって、 ピロリ菌 を検出し、その薬剤耐性を評価するための迅速かつ包括的な技術の開発は、臨床現場での効果的な除去に不可欠です¹⁵。分子検出技術の中で、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は大きな進歩を遂げています。標準的なPCRとは異なり、qPCRはゲル電気泳動の必要性を排除し、アニーリング段階で特定のプライマーとプローブを組み込むことにより、DNAまたはRNAの正確な定量を可能にします。市販のqPCRキットは、 現在、ピロリ菌 の感染と薬剤耐性を特定する機能を提供しています¹⁶。

基本的に、 ピロリ菌 感染の検出と薬剤耐性の評価を同時に行うことができる、強力で包括的な診断アプローチが直ちに臨床的に必要とされています。 ピロリ菌 の検出と抗生物質耐性のために、さまざまなプライマープローブを使用した胃粘膜qPCR分析を採用しました。

プロトコル

既存の研究は、中国広州市南医科大学広東省人民病院の倫理委員会によって確立された倫理的考慮事項に準拠して実施されました (承認番号: KY2024-1115-01)。18歳から60歳までの患者がこの研究に登録されました。この研究では、参加者が最近抗生物質、抗菌薬草療法、プロトンポンプ阻害剤 (PPI)、または_H2 受容体拮抗薬を投与していた場合、試験前の 2 週間以内に除外されました。また、過去3カ月以内に抗ピロリ 菌療法を受けた方、または心臓、肝臓、腎臓に重大な問題がある方、重度の神経障害、精神障害のある方は参加資格がありませんでした。胃腸穿孔、高齢、不安定なバイタルサインなど、胃内視鏡検査が禁忌の人は除外されました。この研究には、妊娠中または授乳中の女性も含まれていませんでした。被験者のインフォームドコンセントフォームには、主に次の内容が含まれています:(1)研究の背景と目的。(2)本研究プロジェクトへの参加に不適当なのはどのような方ですか?(3)研究に参加するための要件は何ですか?(4)研究に参加することで得られる可能性のある利益。(5) 副作用、リスク、不快感のおそれ(6)プライバシー保護。(7)対象の権利。(8)被験者の宣言。(9)研究者声明等

1. 胃粘膜の採取

1. サンプリング消耗品の調製
   1. samp保存溶液を含むサンプリングチューブ。
   2. 胃鏡生検鉗子を準備します。
2. サンプリング対象物の準備
   1. 慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃がん、またはその疑いのある患者から検体を採取します。アセプティック手順を維持しながらサンプルを採取します。
      注:収集された標本には、患者または疑わしい患者の胃粘膜組織が含まれていました。
   2. 薬物の履歴を確認します。
      1. ピロリ菌の抗生物質とビスマスが4週間以内に患者に服用されていないこと、および2週間以内に酸阻害剤が服用されていないことを確認してください。
      2. 抗凝固薬(ワルファリン、アスピリン、クロピドグレルなど)を服用している患者に、5〜7日間薬の服用を中止するよう依頼してください。
3. 標本の収集
   1. サンプリングサイト
      1. 新しいシドニーシステムの要件に従って、胃の通路、胃体の大小の曲がり、および胃の角(合計5ポイント)から生検サンプルを採取します。特定のサイトを 図 1 に示します。幽門輪から2〜3cmの幽門洞の小さな曲がり(A₁)と大きな曲がり(A₂)。胃から4cm(B₁)および心臓から8cmの大きな曲がり(B₂)。胃コーナー(IA)。
      2. 中国における消化器内視鏡生検および病理学的検査の標準化に関する専門家のコンセンサス(草案)によると、胃洞の小さい側から5cmの幽門(胃の角に隣接)または胃の角の大きい側(生検1〜2個)から生検サンプルを採取します。
   2. 特殊サンプルの収集場所の説明
      1. 治療を受けている患者の場合、4週間の離脱後、胃前庭部と胃体のサンプルを同時に採取します。.
      2. 胃がんの患者さんは、腫瘍組織ではなく、胃の大きな湾曲から組織を採取します。
      3. 胃潰瘍の患者さんは、胃前庭部と胃潰瘍縁組織を採取します。潰瘍の底を拾わないでください。
      4. 萎縮性胃炎の患者には、胃前庭部と胃体を採取します。胃粘膜の萎縮や腸の化生領域からサンプルを採取しないでください。
   3. サンプリング手順
      1. 生検クランプ弁を開き、ゆっくりと利き手に移動します。鉗子の頭部が視界に入ったら、クランプフラップを開き、サンプリング部位の胃粘膜にある内視鏡を操作します。
      2. わずかな圧力を加え、生検鉗子を閉じ、胃粘膜組織(直径:0.5〜1 mm、約5〜10 mg /ブロック)をクランプします。サンプリングチューブ内のペンチ(保存液を含む)で組織サンプルを抽出し、サイトを完成させます。
      3. 他の部位のサンプリングを続行して完了し、それらを同じサンプリングチューブ(保存液を含む)に入れます。
      4. すべてのサイトのサンプリングを完了し、サンプリングチューブカバーを締め、乾燥を防ぐためにシールします。チューブの外側に固有の識別番号をラベル付けします。
      5. 収集したサンプルは、できるだけ早くテストのために提出してください。サンプルを室温(RT)に24時間以上置かないでください。長距離輸送中に臨床検体の凍結と解凍を繰り返さないでください。-20°C±5°Cの温度が確保できない場合は、0〜8°Cで輸送してください。 サンプルは-20°C±5°Cで5か月間保存し、長期保存する場合は-70°C未満に保ちます。
   4. 注意 事項
      1. サンプリングするときは、生検鉗子をできるだけ深く押して、粘膜の全層に到達します。
      2. 生検鉗子を抜いて生検を開くときは、粘膜の裂傷を防ぐために優しくしてください。

2. 核酸抽出

1. 事前に金属浴の温度を100°Cに調整してください。サンプルが凍結している場合は、サンプルを取り外してRTに戻します。
2. ライセートをよく混合して、イミノ二酢酸樹脂を懸濁します。100 μLのライセートをフィルターエレメントで遠心チューブに取り込むか、200 μLのライセートで胃粘膜組織を直接遠心チューブに加え、ボルテックス振動で混合します。
3. 遠心分離管を100°Cの金属浴に10分間入れ、取り出して室温まで冷却します。
4. 9500gで5〜10分間遠心分離します。上清を別の滅菌した遠心分離チューブに慎重に引き込み、印を付けます。
5. すぐに次の実験を行うか、4°Cで一時的に保管して検査してください。

3. ピロリ菌 および薬剤耐性遺伝子(クラリスロマイシンおよびキノロン)のqPCRによる検出

1. プライマープローブ、混合酵素溶液、および検出バッファーをキットから取り出します。すべての成分を氷または2〜8°Cで溶かし、わずかに振とうして低速で瞬間的に遠心分離して混合します。
2. 検出バッファー12.5μL+プライマープローブ7.0μL+酵素溶液0.5μLを混合します。最初に各試薬の量を計算し、適切な容量の遠心分離チューブに追加し、よく混合し、短時間遠心分離します。
   注:PCR反応液の総量は、テストサンプルの数、1つの強陽性コントロール、1つの弱い陽性コントロール、1つの陰性コントロール、および1つのPCR陰性コントロールを含めて計算する必要があります。
3. PCR反応液を設定したら、各PCR反応ウェルに20.0μLのPCR反応液を添加します。次に、PCR反応液で5.0μLの核酸をPCR反応ウェルに加えます。サンプルや核酸をPCRネガティブコントロールウェルに添加しないでください。
4. 反応チューブを蛍光PCRサーモサイクラーに入れ、サイクルパラメータを次のように設定します:まず、反応混合物を42°Cおよび95°Cで2分間加熱します。次に、95°Cで10秒間変性し、アニールして58°Cで45秒間伸ばし、40サイクル繰り返します。
5. 蛍光シグナルをFAM(23S rRNA gene mutation)、HEX/VIC(gyrA gene mutation)、ROX(H. pylori)、CY5(内部標準)として収集し、58°Cでデータを取得します。
6. 反応後、データを保存し、特定のqPCRソフトウェアを使用して分析します。

結果

qPCRによる胃組織におけるピロリ菌感染と抗生物質耐性の評価
ピロリ菌を同定するためのqPCRアッセイは、尿素A遺伝子を標的として実施し、23S rRNAおよびgyrA遺伝子の特異的変異を調べることにより、抗生物質耐性を確認しました(表1)。3つのグループすべてのCT値で表される品質保証デー?...

ディスカッション

RUT、UBT、組織学、培養、血清学などの従来の検査は、 ピロリ菌 の検出に利用されています。各診断アプローチには明確な利点があり、臨床状況に応じて特定の課題に直面しています¹⁷。胃粘膜生検からの ピロリ菌 の培養は、診断の基準と見なされることがよくあります。それにもかかわらず、この方法は労働集約的であり、その精度...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Incubator	ALLSHENG	MK2000-2	Provide a constant temperature environment
Biosafety cabinet	Haier	HR1500-B2
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	THERMO ST16R	Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
Chelex-100	sigma	C7901	Resin
Gastroscope biopsy forceps	Boston Scientific Corporation		Sampling of the gastric mucosa
Helicobacter pylori 23S rRNA gene and gyrA gene mutation detection kit	Jiangsu Mole Bioscience	CFDA 20223400137	qPCR detection kit for H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Nucleic acid extraction reagent	Jiangsu Mole Bioscience	SEDA 20150076	For DNA extraction
SDS Software	Applied Biosystems	7300/7500	Data analysis
Thermocylcer	Thermo Fisher Scientific	ABI 7500	For qPCR detection of H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Vortex mixer	JOANLAB	VM-5005	For mixing reagent