Quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse der Magenschleimhaut zum Nachweis von Helicobacter pylori und Antibiotikaresistenz

Zusammenfassung

Eine schnelle und genaue Methode zum Nachweis von H. pylori und zur Prüfung von Arzneimittelresistenzen ist für die effiziente Ausrottung von H. pylori in der klinischen Praxis von großer Bedeutung. Ziel dieses Protokolls ist es, eine spezifische Methodik vorzustellen, die die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Magenschleimhaut zum schnellen Nachweis von H. pylori und Antibiotikaresistenz umfasst.

Zusammenfassung

Helicobacter pylori ist ein Haupterreger, der fast die Hälfte der Weltbevölkerung infiziert und aufgrund seiner zunehmenden Antibiotikaresistenz die öffentliche Gesundheit bedroht. Darüber hinaus ist Helicobacter pylori auch für chronische Gastritis, Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre, Magenkarzinom und Magenschleimhaut-assoziiertes lymphatisches Gewebe (MALT) Lymphom verantwortlich. Daher ist es wichtig, eine rechtzeitige und genaue Diagnose von H. pylori durchzuführen und seine Antibiotikaresistenz zu bestimmen. Zu den bestehenden Methoden der H . pylori-Diagnostik gehören heute vor allem der Urease-Schnelltest (RUT), der Harnstoff-Atemtest (UBT), der Serum-Antikörper-Test, der Antigen-Test, die Gastroskopie und die Bakterienkultur. Mit den ersten fünf Nachweismethoden konnten Bakterien jedoch nicht kultiviert werden, ganz zu schweigen vom Nachweis von Arzneimittelresistenzen. Die Bakterienkultur ist zeitaufwändig, und Antibiotika-Empfindlichkeitstests können nicht schnell und routinemäßig durchgeführt werden. Im klinischen Umfeld ist die schnelle und genaue Identifizierung von H. pylori und seiner Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika entscheidend für seine effektive Eliminierung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen gezielten Ansatz unter Verwendung der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) an Magenschleimhautproben zu skizzieren, um die Diagnose von H. pylori zu beschleunigen und seine Resistenz gegen antimikrobielle Wirkstoffe zu bewerten. qPCR wurde genutzt, um das Harnstoff-Gen für eine H. pylori-Infektion und Mutationen in den 23S rRNA- und gyrA-Genen nachzuweisen, die mit einer Resistenz gegen Clarithromycin bzw. Chinolone assoziiert sind. Derzeit gibt es bei der qPCR der Magenschleimhaut aufgrund des Mangels an Standardarbeitsanweisungen nach wie vor Herausforderungen. Daher ist es wichtig, Methoden mit experimentellen Details zu teilen, um eine genaue Kommunikation der experimentellen Verfahren zu gewährleisten und zu Goldstandard-Protokollen beizutragen, die eine größere Transparenz ermöglichen. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine kostengünstige und kostengünstige Alternative zu herkömmlichen Methoden zur Beurteilung der H.pylori-Infektion und ihrer Resistenz gegen Antibiotika durch die Anwendung der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Technologie.

Einleitung

H. pylori ist ein gramnegatives Bakterium, das bei niedrigem Sauerstoffgehalt überleben kann. Der Organismus gehört zu mehreren unterschiedlichen genetischen Populationen und weist eine hohe genetische Vielfalt auf. Obwohl der Organismus normalerweise spiralförmig ist, könnte er in einen Stab¹ umgewandelt werden. Es ist ein Haupterreger, der fast 50 % der Weltbevölkerung infiziert². Meistens tritt eine Infektion auf, wenn Patienten in der Kindheit gesunde Träger bleiben und sich die Symptome später im Erwachsenenalter manifestieren. Es wurde berichtet, dass es mit chronischer Gastritis, Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren, Magenkarzinom und Magenschleimhaut-assoziiertem lymphatischem Gewebe (MALT) Lymphom verwandt ist³. Unterschiede in den Manifestationen der H. pylori-Infektion könnten auf die Pathogenitätselemente verschiedener Bakterienstämme sowie auf die Eigenschaften des Wirts und seine Ernährungsmuster zurückzuführen^{sein 4}. Die Forschung zeigt, dass Männer, die rauchen und Alkohol konsumieren, ein höheres Risiko haben, an H. pylori-Infektionen zu erkranken⁵. Die Wirksamkeit der Eliminierung von H. pylori zur Vorbeugung von Magenkrebs und Krebsvorstufen wurde in mehreren Studien nachgewiesen ^6,7. Daher wurde die Ausrottung von H. pylori von der Internationalen Agentur für Krebsforschung der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als vorbeugende Maßnahme empfohlen⁸.

Die schnelle und genaue Diagnose einer H. pylori-Infektion ist für die meisten Menschen, die an asymptomatischer Dyspepsie leiden, ein entscheidender Bestandteil der Behandlung. Die Diagnose von H. pylori beinhaltet eine Kombination aus sowohl invasiven als auch nicht-invasiven Ansätzen. Zu den invasiven Techniken gehören in der Regel die Endoskopie zur direkten Visualisierung, die histologische Analyse von Gewebeproben, der Urease-Schnelltest (RUT) zum Nachweis der bakteriellen Aktivität und die Kultivierung der Bakterien. Auf der anderen Seite umfassen nicht-invasive Strategien den Harnstoff-Atemtest (UBT), der den bakteriellen Stoffwechsel misst; der Stuhlantigen-Test (SAT), der bakterielle Proteine im Kot nachweist; serologische Tests, die nach Antikörpern im Blut suchen; und molekulare Diagnostika, bei denen genetisches Material zum Nachweis verwendet wird. Während jede dieser diagnostischen Methoden ihre eigenen Vor- und Nachteile mit sich bringt, gibt es im Bereich der klinischen Praxis keine einzige Methode, die allgemein als ultimativer Maßstab anerkannt ist⁹.

Derzeit besteht die primäre Behandlung von H. pylori-Infektionen aus Antibiotika. Die Erfolgsraten antimikrobieller Therapien zur Ausrottung von H. pylori sind jedoch rückläufig, was auf verschiedene Faktoren zurückzuführen ist. Die Hauptursachen für die Unwirksamkeit der Behandlung werden in der Resistenz der Bakterien gegen antimikrobielle Wirkstoffe und der Einhaltung des verordneten Schemas durch die Patienten vermutet¹⁰. Insbesondere Stämme von H. pylori, die gegen Clarithromycin resistent sind, waren Gegenstand umfangreicher^{Forschungen 11}. Die Häufigkeit solcher Resistenzen nimmt in zahlreichen Ländern zu. Die Resistenz von H. pylori ist hauptsächlich auf Mutationen im variablen Region-Gen der 23S rRNA zurückzuführen, das Konformationsänderungen im Ribosom verursacht. Infolgedessen verändert sich die Bindungsstelle für Clarithromycin, was zu einer geschwächten Affinität zwischen H. pylori und Clarithromycin führt und die Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese verhindert¹². Es ist bekannt, dass Mutationen an den Positionen A2143G, A2142G und A2142C innerhalb des 2,9 kb-Segments des 23S rRNA-Gens eine Resistenz gegen Clarithromycin verleihen. Auch die Ausbreitung von Resistenzen gegen Fluorchinolone stand im Fokus zahlreicher Untersuchungen. Studien haben Resistenzraten gegen Levofloxacin von 34,5 % in China und 22,1 % in Italien dokumentiert¹³. Chinolon-Medikamente wirken hauptsächlich auf die Topoisomerase II von H. pylori, indem sie die Enzymaktivität hemmen, die DNA-Synthese und -Replikation sowie die Sekundärstruktur beeinflussen und dadurch antibakterielle Zwecke erreichen. Treten Mutationen in den Genen auf, die für die Topoisomerase-Untereinheiten gyrA und gyrB kodieren, verhindert dies die Bindung von Antibiotika wie Levofloxacin und dem Enzym, was dazu führt, dass die Replikation des H. pylori-Genoms nicht mehr gehemmt werden kann, was zu Resistenzen führt. Dabei konzentrieren sich die Hotspots von Mutationen im gyrA-Gen auf die Aminosäuren 87 und 91, während Mutationen im gyrB-Gen seltener auftreten und häufig von Mutationen in gyrA¹⁴ begleitet werden. Zu den Mutationsloci des Levofloxacin-Resistenzgens gehören hauptsächlich die sechs Mutationsstellen (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G), die sich im Gyr-A-Gen befinden. Die Identifizierung von Resistenzmechanismen, die auf genetische Veränderungen zurückzuführen sind, hat zu einem fortschreitenden Übergang beim Nachweis von H. pylori geführt, weg von kulturbasierten Methoden hin zu molekulardiagnostischen Techniken.

UBT und SAT sind die am häufigsten gewählten nicht-invasiven Tests, aber sie können keine Informationen über die Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten liefern. Folglich ist die Entwicklung einer schnellen und umfassenden Technik zum Nachweis von H. pylori und zur Beurteilung seiner Resistenz gegen Medikamente entscheidend für seine wirksame Eliminierung im klinischen Umfeld¹⁵. Unter den molekularen Nachweistechniken hat die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) erhebliche Fortschritte gemacht. Im Gegensatz zur Standard-PCR macht die qPCR eine Gelelektrophorese überflüssig und ermöglicht die präzise Quantifizierung von DNA oder RNA durch den Einbau spezifischer Primer und Sonden während der Annealing-Phase. Kommerziell erhältliche qPCR-Kits bieten jetzt die Möglichkeit, H . pylori-Infektionen und Resistenzen gegen Medikamente zu identifizieren¹⁶.

Grundsätzlich besteht ein unmittelbarer klinischer Bedarf an einem diagnostischen Ansatz, der sowohl wirksam als auch umfassend ist und in der Lage ist, H . pylori-Infektionen zu erkennen und gleichzeitig die Arzneimittelresistenz zu beurteilen. Wir haben die qPCR-Analyse der Magenschleimhaut für den Nachweis von H. pylori und Antibiotikaresistenz mit verschiedenen Primersonden eingeführt.

Protokoll

Die bestehende Studie wurde in Übereinstimmung mit ethischen Erwägungen durchgeführt, die von der Ethikkommission des Volkskrankenhauses der Provinz Guangdong der Southern Medical University, Guangzhou, China, festgelegt wurden (Zulassungsnummer: KY2024-1115-01). Patienten im Alter von 18 bis 60 Jahren wurden in diese Studie aufgenommen. Für diese Studie wurden Teilnehmer ausgeschlossen, die innerhalb der 2 Wochen vor dem Test kürzlich Antibiotika, antibakterielle pflanzliche Heilmittel, Protonenpumpenhemmer (PPIs) oder H₂ -Rezeptorantagonisten eingenommen hatten. Darüber hinaus waren Personen, die sich innerhalb der letzten 3 Monate einer Anti-H. pylori-Therapie unterzogen hatten, oder Personen mit signifikanten Herz-, Leber- oder Nierenproblemen, schwerer Neuropathie oder psychiatrischen Störungen nicht zur Teilnahme berechtigt. Ausgeschlossen wurden Personen mit Kontraindikationen für eine gastroskopierische Untersuchung, wie z. B. gastrointestinale Perforation, fortgeschrittenes Alter, instabile Vitalfunktionen usw. Die Studie umfasste auch keine schwangeren oder stillenden Frauen. Die Einwilligungserklärung der Probanden umfasst im Wesentlichen folgende Inhalte: (1) Forschungshintergrund und -zweck; (2) Wer ist für die Teilnahme an diesem Forschungsvorhaben ungeeignet? (3) Was sind die Voraussetzungen für die Teilnahme an der Forschung? (4) Mögliche Vorteile der Teilnahme an der Forschung; (5) Mögliche Nebenwirkungen, Risiken und Beschwerden; (6) Schutz der Privatsphäre; (7) Rechte der betroffenen Personen; (8) Erklärung des Gegenstands; (9) Aussage des Forschers usw.

1. Entnahme der Magenschleimhaut

1. Vorbereitung der Probenahme von Verbrauchsmaterialien
   1. Bereiten Sie das Probenahmeröhrchen mit der Aufbewahrungslösung vor.
   2. Bereiten Sie die Gastroskop-Biopsiezange vor.
2. Vorbereitung der Probenahmeobjekte
   1. Sammeln Sie Proben von Patienten mit chronischer Gastritis, Magengeschwüren, Zwölffingerdarmgeschwüren, Magenkrebs oder Verdachtspatienten. Entnahme von Proben unter Beibehaltung der aseptischen Verfahren.
      HINWEIS: Die entnommenen Proben enthielten Magenschleimhautgewebe von Patienten oder Verdachtspatienten.
   2. Bestätigen Sie die Medikamentenanamnese.
      1. Stellen Sie sicher, dass der Patient innerhalb von 4 Wochen keine Antibiotika und Wismut gegen H. pylori einnimmt und dass innerhalb von 2 Wochen kein Säurehemmer eingenommen wird.
      2. Bitten Sie Patienten, die Antikoagulanzien (Warfarin, Aspirin, Clopidogrel usw.) einnehmen, die Einnahme von Medikamenten für 5-7 Tage abzubrechen.
3. Entnahme von Proben
   1. Ort der Probenahme
      1. Entsprechend den Anforderungen des neuen Sydney-Systems entnehmen Sie Biopsieproben aus dem Magenantrum, der großen und kleinen Biegung des Magenkörpers und dem Magenwinkel (insgesamt 5 Punkte). Die einzelnen Standorte sind in Abbildung 1 dargestellt. Eine kleine Biegung der Pylorushöhle 2-3 cm vom Pylorusring entfernt (A₁) und eine große Biegung (A₂); 4 cm vom Bauch entfernt (B₁) und eine große Biegung 8 cm von der Kardia (B₂); Magenecke (IA).
      2. Gemäß dem Expertenkonsens über die Standardisierung der endoskopischen Biopsie des Verdauungstrakts und der pathologischen Untersuchung in China (Entwurf) sind Biopsieproben von der kleinen Seite des Magensinus 5 cm vom Pylorus entfernt (neben dem Magenwinkel) oder von der großen Seite des Magenwinkels (Biopsie 1-2 Stück) zu entnehmen.
   2. Beschreibung des Entnahmeortes von Sonderproben
      1. Bei Patienten, die sich einer Behandlung unterziehen, entnehmen Sie nach einem Entzug für 4 Wochen gleichzeitig Magenantrum und Magenkörperproben.
      2. Bei Patienten mit Magenkrebs entnehmen Sie Gewebe aus der großen Krümmung des Magens, aber nicht aus dem Tumorgewebe.
      3. Bei Patienten mit Magengeschwüren entnehmen Sie das Magenantrum und das Randgewebe des Magengeschwürs. Sammeln Sie nicht den Boden des Geschwürs.
      4. Bei Patienten mit atrophischer Gastritis nehmen Sie Magenantrum und Magenkörper. Entnehmen Sie keine Proben aus Bereichen der Magenschleimhautatrophie und der Darmmetaplasie.
   3. Schritte zur Probenahme
      1. Öffnen Sie das Biopsie-Klemmventil und bewegen Sie es langsam zur dominanten Hand. Wenn sich der Kopf der Pinzette im Sichtfeld befindet, öffnen Sie die Klemmklappe und manipulieren Sie das Endoskop an der Magenschleimhaut der Probenahmestelle.
      2. Üben Sie einen leichten Druck aus, schließen Sie die Biopsiezange und klemmen Sie das Magenschleimhautgewebe fest (Durchmesser: 0,5-1 mm, ca. 5-10 mg/Block). Entnehmen Sie die Gewebeproben mit der Zange im Probenahmeröhrchen (einschließlich Konservierungsflüssigkeit), um die Stelle zu vervollständigen.
      3. Fahren Sie mit der Probenahme anderer Stellen fort und legen Sie sie in dasselbe Probenahmeröhrchen (einschließlich Konservierungslösung).
      4. Schließen Sie die Probenahme an allen Stellen ab, ziehen Sie die Abdeckung des Probenahmeröhrchens fest und versiegeln Sie sie, um ein Austrocknen zu verhindern. Beschriften Sie die Röhrchen mit einer eindeutigen Identifikationsnummer auf der Außenseite.
      5. Senden Sie die entnommenen Proben so schnell wie möglich zur Testung. Lagern Sie die Proben nicht länger als 24 Stunden bei Raumtemperatur (RT). Vermeiden Sie das wiederholte Einfrieren und Auftauen klinischer Proben während des Langstreckentransports. Wenn eine Temperatur von -20 ± 5 °C nicht gewährleistet werden kann, transportieren Sie sie bei 0-8 °C. Lagern Sie die Proben für einen Zeitraum von fünf Monaten bei -20 ± 5 °C und für die Langzeitlagerung unter -70 °C.
   4. Vorsichtsmaßnahmen
      1. Drücken Sie bei der Probenahme die Biopsiezange so tief wie möglich, um die gesamte Schleimhautschicht zu erreichen.
      2. Seien Sie beim Entfernen der Biopsiezange und beim Öffnen der Biopsie vorsichtig, um Schleimhautrisse zu vermeiden.

2. Nukleinsäure-Extraktion

1. Stellen Sie die Temperatur des Metallbades im Voraus auf 100 °C ein; Wenn die Probe eingefroren ist, entfernen Sie sie und stellen Sie die RT-Version wieder her.
2. Mischen Sie das Lysat gut, um das Iminodiessigsäureharz zu suspendieren. Nehmen Sie 100 μl Lysat in das Zentrifugalröhrchen mit dem Filterelement oder geben Sie das Magenschleimhautgewebe direkt mit 200 μl Lysat in das Zentrifugenröhrchen und mischen Sie es mit Wirbeloszillation.
3. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen 10 Minuten lang bei 100 °C in ein Metallbad, nehmen Sie es dann heraus und kühlen Sie es auf RT ab.
4. Bei 9500 g für 5-10 min zentrifugieren. Ziehen Sie den Überstand vorsichtig in ein anderes sterilisiertes Zentrifugenröhrchen und markieren Sie ihn.
5. Führen Sie sofort den folgenden Versuch durch oder lagern Sie ihn zur Inspektion bei 4 °C zwischen.

3. qPCR-Nachweis von H. pylori und Arzneimittelresistenz-Genen (Clarithromycin und Chinolone)

1. Entfernen Sie die Primersonde, die gemischte Enzymlösung und den Nachweispuffer aus dem Kit. Schmelzen Sie alle Komponenten auf Eis oder 2-8 °C und mischen Sie sie unter leichtem Schütteln und sofortiger Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit.
2. Mischen Sie 12,5 μl Detektionspuffer + 7,0 μl Primersonde + 0,5 μl Enzymlösung. Berechnen Sie zuerst die Menge jedes Reagenzes, geben Sie es in das entsprechende Volumen-Zentrifugenröhrchen, mischen Sie es gut und zentrifugieren Sie es kurz.
   HINWEIS: Die Gesamtmenge der PCR-Reaktionslösung sollte berechnet werden, indem die Anzahl der Testproben, eine starke Positivkontrolle, eine schwache Positivkontrolle, eine Negativkontrolle und eine PCR-Negativkontrolle einbezogen werden.
3. Nachdem die PCR-Reaktionslösung konfiguriert wurde, geben Sie 20,0 μl der PCR-Reaktionslösung in jede PCR-Reaktionsvertiefung. Geben Sie dann 5,0 μl Nukleinsäure mit der PCR-Reaktionslösung in die PCR-Reaktionsvertiefung. Geben Sie keine Probe oder Nukleinsäure in die PCR-Negativkontrollvertiefung.
4. Setzen Sie das Reaktionsröhrchen in den fluoreszierenden PCR-Thermocycler ein und stellen Sie die Zyklusparameter wie folgt ein: Zuerst erhitzen Sie das Reaktionsgemisch 2 min lang auf 42 °C und 95 °C; zweitens 10 s bei 95 °C denaturieren, glühen und für 45 s bei 58 °C verlängern, 40 Zyklen wiederholen.
5. Erfassen Sie die Fluoreszenzsignale als FAM (23S rRNA-Genmutation), HEX/VIC (gyrA-Genmutation ), ROX (H. pylori) und CY5 (interner Standard) sowie Daten bei 58 °C.
6. Speichern Sie die Daten nach der Reaktion und analysieren Sie sie mit einer speziellen qPCR-Software.

Ergebnisse

Beurteilung der H. pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz im Magengewebe mittels qPCR
Die qPCR-Assays zur Identifizierung von H. pylori wurden durch Targeting des Harnstoff-Gens durchgeführt, und die Antibiotikaresistenz wurde durch die Untersuchung spezifischer Mutationen in den Genen 23S rRNA und gyrA festgestellt (Tabelle 1). Die Qualitätssicherungsdaten, dargestellt durch d...

Diskussion

Traditionelle Tests wie RUT, UBT, Histologie, Kultivierung sowie Serologie werden für den Nachweis von H. pylori genutzt. Jeder diagnostische Ansatz bietet je nach klinischem Kontext unterschiedliche Vorteile und steht vor spezifischen Herausforderungen¹⁷. Die Kultivierung von H. pylori aus Magenschleimhautbiopsien wird oft als Maßstab für die Diagnose angesehen. Nichtsdestotrotz ist diese Methode arbeitsintensiv, und ihre Genauigkeit wird dur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Incubator	ALLSHENG	MK2000-2	Provide a constant temperature environment
Biosafety cabinet	Haier	HR1500-B2
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	THERMO ST16R	Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
Chelex-100	sigma	C7901	Resin
Gastroscope biopsy forceps	Boston Scientific Corporation		Sampling of the gastric mucosa
Helicobacter pylori 23S rRNA gene and gyrA gene mutation detection kit	Jiangsu Mole Bioscience	CFDA 20223400137	qPCR detection kit for H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Nucleic acid extraction reagent	Jiangsu Mole Bioscience	SEDA 20150076	For DNA extraction
SDS Software	Applied Biosystems	7300/7500	Data analysis
Thermocylcer	Thermo Fisher Scientific	ABI 7500	For qPCR detection of H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Vortex mixer	JOANLAB	VM-5005	For mixing reagent