Количественный анализ полимеразной цепной реакции слизистой оболочки желудка для выявления Helicobacter pylori и антибиотикорезистентности

Резюме

Быстрый и точный метод обнаружения H. pylori и тестирования лекарственной устойчивости имеет большое значение для эффективной эрадикации H. pylori в клинической практике. Этот протокол направлен на то, чтобы представить конкретную методологию, включающую количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР) слизистой оболочки желудка для быстрого выявления H. pylori и устойчивости к антибиотикам.

Аннотация

Helicobacter pylori является основным патогеном, который инфицирует почти половину населения мира и угрожает общественному здравоохранению из-за своей растущей устойчивости к антибиотикам. Кроме того, Helicobacter pylori также отвечает за хронический гастрит, язву желудка и двенадцатиперстной кишки, карциному желудка и лимфому, ассоциированную со слизистой оболочкой желудка (MALT). Поэтому крайне важно провести своевременную и точную диагностику H. pylori и определение ее антибиотикорезистентности. В настоящее время существующие методы диагностики H. pylori в основном включают экспресс-тест на уреазу (RUT), уреа-дыхательный тест (UBT), тест на сывороточные антитела, тест на антиген, гастроскопию, бактериальный посев. Тем не менее, бактерии не могут быть культивированы с помощью первых пяти методов обнаружения, не говоря уже о выявлении лекарственной устойчивости. Бактериологическое исследование занимает много времени, а тесты на чувствительность к антибиотикам не могут быть проведены быстро и в плановом порядке. В клинических условиях быстрая и точная идентификация H. pylori и ее чувствительности к антибиотикам имеет решающее значение для ее эффективной элиминации. Целью данного протокола является определение целевого подхода с использованием количественной полимеразной цепной реакции (количественной ПЦР) на образцах слизистой оболочки желудка для ускорения диагностики H. pylori и оценки ее устойчивости к противомикробным препаратам. С помощью количественной ПЦР был обнаружен ген ureA для инфекции H. pylori и мутаций в генах 23S рРНК и gyrA , связанных с устойчивостью к кларитромицину и хинолонам, соответственно. В настоящее время остаются проблемы с количественной ПЦР слизистой оболочки желудка из-за отсутствия стандартных операционных процедур. Поэтому важно обмениваться методологиями с экспериментальными деталями, чтобы обеспечить точную передачу экспериментальных процедур, способствуя созданию протоколов золотого стандарта, обеспечивающих большую прозрачность. В целом, этот протокол предлагает экономичную и оперативную альтернативу традиционным методам оценки инфекции H.pylori и ее устойчивости к антибиотикам за счет применения технологии количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).

Введение

H. pylori – грамотрицательная бактерия, которая может выжить при низком уровне кислорода. Организм принадлежит к нескольким различным генетическим популяциям и демонстрирует высокое генетическое разнообразие. Хотя организм обычно имеет спиралевидную форму, его можно изменить на стержень¹. Это основной патоген, которым заражено почти 50% населения планеты². В большинстве случаев инфекция происходит, когда пациенты остаются здоровыми носителями в детстве, а симптомы проявляются позже во взрослом возрасте. Сообщалось, что это связано с хроническим гастритом, язвой желудка и двенадцатиперстной кишки, карциномой желудка и лимфомой, ассоциированной со слизистой оболочкой желудка (MALT)³. Различия в проявлениях инфекции H. pylori могут быть обусловлены патогенностью элементов отдельных бактериальных штаммов, а также особенностями хозяина и его рационом питания⁴. Исследования показывают, что мужчины, курящие и употребляющие алкоголь, подвергаются более высокому риску заражения инфекцией H. pylori ⁵. Эффективность элиминации H. pylori для профилактики рака желудка и предраковых поражений была подтверждена в нескольких исследованиях ^6,7. В связи с этим Международное агентство по изучению рака Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) рекомендовало ликвидацию H. pylori в качестве профилактической меры⁸.

Быстрая и точная диагностика инфекции H. pylori является важной частью лечения для большинства людей, страдающих бессимптомной диспепсией. Диагностика H. pylori включает в себя комбинацию как инвазивных, так и неинвазивных подходов. Инвазивные методы обычно включают эндоскопию для прямой визуализации, гистологический анализ образцов тканей, экспресс-тест на уреазу (RUT) для обнаружения бактериальной активности и культивирование бактерий. С другой стороны, неинвазивные стратегии включают в себя дыхательный тест с мочевиной (UBT), который измеряет метаболизм бактерий; тест на антиген кала (SAT), который обнаруживает бактериальные белки в кале; серологические тесты, которые ищут антитела в крови; и молекулярная диагностика, использующая генетический материал для обнаружения. Несмотря на то, что каждый из этих методов диагностики имеет свои преимущества и недостатки, в клинической практике не существует метода, который был бы общепризнан в качестве конечного ориентира^.

В настоящее время основным методом лечения инфекций H. pylori являются антибиотики. Тем не менее, показатели успеха антимикробной терапии, направленной на эрадикацию H. pylori , снижаются, что объясняется различными факторами. Предполагается, что преобладающими причинами неэффективности лечения являются устойчивость бактерий к антимикробным препаратам и приверженность пациентов назначенному режиму лечения¹⁰. В частности, штаммы H. pylori , устойчивые к кларитромицину, были предметом обширных исследований¹¹. Случаи такого сопротивления растут во многих странах. Резистентность H. pylori в основном обусловлена мутациями в гене вариабельной области 23S рРНК, что вызывает конформационные изменения в рибосоме. Следовательно, изменяется сайт связывания кларитромицина, что приводит к ослаблению сродства между H. pylori и кларитромицином, препятствуя ингибированию синтеза бактериального белка¹². Известно, что мутации в положениях A2143G, A2142G и A2142C в сегменте 2,9 kb гена 23S рРНК придают устойчивость к кларитромицину. Распространение устойчивости к фторхинолонам также было в центре внимания многочисленных исследований. Исследования показали, что уровень резистентности к левофлоксацину составляет 34,5% в Китае и 22,1% в Италии¹³. Препараты хинолонов в основном действуют на топоизомеразу II H. pylori, подавляя активность ферментов, влияя на синтез и репликацию ДНК и вторичную структуру, тем самым достигая антибактериальных целей. Если мутации происходят в генах, кодирующих субъединицы топоизомеразы , gyrA и gyrB, это будет препятствовать связыванию антибиотиков, таких как левофлоксацин и фермент, что приведет к неспособности ингибировать репликацию генома H. pylori , что вызовет резистентность. Среди них горячие точки мутаций в гене gyrA сосредоточены на аминокислотах 87 и 91, в то время как мутации в гене gyrB происходят реже и часто сопровождаются мутациями в gyrA¹⁴. Локусы мутации гена резистентности к левофлоксацину в основном включают шесть сайтов мутации (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G), расположенных в гене gyrA. Выявление механизмов резистентности, обусловленных генетическими изменениями, привело к постепенному переходу в детекции H. pylori, переходя от методов, основанных на культурах, к методам молекулярной диагностики.

UBT и SAT являются наиболее часто выбираемыми неинвазивными тестами, но они не могут предоставить информацию о чувствительности к лекарствам. Следовательно, разработка быстрой и комплексной методики обнаружения H. pylori и оценки ее устойчивости к лекарственным препаратам имеет решающее значение для ее эффективной элиминации в^{клинических условиях.} Среди методов молекулярного детектирования значительный прогресс был достигнут в количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). В отличие от стандартной ПЦР, кПЦР устраняет необходимость в гель-электрофорезе и позволяет точно количественно определить ДНК или РНК за счет включения специальных праймеров и зондов на этапе отжига. Коммерчески доступные наборы для количественной ПЦР в настоящее время позволяют выявлять инфекции H. pylori и устойчивость к лекарственным препаратам¹⁶.

В принципе, существует непосредственная клиническая потребность в диагностическом подходе, который был бы одновременно мощным и всеобъемлющим, способным выявлять инфекции H. pylori и одновременно оценивать лекарственную устойчивость. Мы использовали кПЦР-анализ слизистой оболочки желудка для выявления H. pylori и антибиотикорезистентности с использованием различных праймерных зондов.

протокол

Существующее исследование было проведено в соответствии с этическими соображениями, установленными этическим комитетом Народной больницы провинции Гуандун, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Китай (номер одобрения: KY2024-1115-01). В исследование были включены пациенты в возрасте от 18 до 60 лет. Для этого исследования участники были исключены, если они недавно принимали антибиотики, антибактериальные растительные средства, ингибиторы протонной помпы (ИПП) или антагонисты рецепторов_H2 в течение 2 недель до тестирования. Кроме того, лица, которые проходили терапию против H. pylori в течение последних 3 месяцев, или лица со значительными проблемами с сердцем, печенью или почками, тяжелой невропатией или психическими расстройствами, не имели права на участие. Были исключены те, у кого были противопоказания к гастроскопическому исследованию, такие как перфорация желудочно-кишечного тракта, преклонный возраст, нестабильные жизненные показатели и т.д. В исследование также не включались беременные или кормящие женщины. Форма информированного согласия субъектов в основном включает в себя следующее содержание: (1) предпосылки и цель исследования; (2) Кто не подходит для участия в данном исследовательском проекте? (3) Каковы требования для участия в исследовании? (4) Возможные выгоды от участия в исследованиях; (5) Возможные побочные реакции, риски и дискомфорт; (6) Защита неприкосновенности частной жизни; (7) Права субъекта; (8) Декларация о предмете; (9) Заключение исследователя и т.д.

1. Забор слизистой оболочки желудка

1. Подготовка расходных материалов для отбора проб
   1. Подготовьте пробоотборную трубку, содержащую раствор для хранения.
   2. Подготовьте гастроскоп с помощью биопсийных щипцов.
2. Подготовка объектов отбора проб
   1. Соберите образцы у пациентов с хроническим гастритом, язвой желудка, двенадцатиперстной кишки, раком желудка или у пациентов с подозрением на это. Соберите образцы, соблюдая асептические процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные образцы включали ткань слизистой оболочки желудка пациентов или пациентов с подозрением на это.
   2. Подтвердите историю приема лекарств.
      1. Убедитесь, что пациент не принимает антибиотики и висмут для лечения H. pylori в течение 4 недель, а ингибиторы кислот не принимаются в течение 2 недель.
      2. Попросите пациентов, принимающих антикоагулянтные препараты (варфарин, аспирин, клопидогрел и др.), прекратить прием лекарств на 5-7 дней.
3. Сбор образцов
   1. Место отбора проб
      1. В соответствии с требованиями новой системы Сиднея, возьмите образцы биопсии из антрального отдела желудка, большого и малого изгиба тела желудка, а также уголка желудка (всего 5 баллов). Конкретные сайты показаны на рисунке 1. Небольшой изгиб привратного синуса в 2-3 см от пилорического кольца (А₁) и большой изгиб (А₂); 4 см от живота (В₁) и большой изгиб в 8 см от кардии (В₂); желудочный уголок (IA).
      2. В соответствии с Экспертным консенсусом по стандартизации эндоскопической биопсии пищеварительного трактата и патологического обследования в Китае (Draft), берут образцы биопсии с малой стороны желудочного синуса в 5 см от привратника (примыкает к желудочному уголку) или с большой стороны желудочного уголка (биопсия 1-2 штуки).
   2. Описание сбора, места нахождения специальных образцов
      1. Для пациентов, получающих любое лечение, после отмены в течение 4 недель одновременно собирают образцы желудочного отдела и тела желудка.
      2. Для пациентов с раком желудка собирайте ткань из большой кривизны желудка, но не из опухолевой ткани.
      3. У пациентов с язвой желудка соберите ткань антрального отдела желудка и края язвы желудка. Не собирайте дно язвы.
      4. Для пациентов с атрофическим гастритом собирают желудочный антральный отдел и тело желудка. Не собирайте образцы из областей атрофии слизистой оболочки желудка и кишечной метаплазии.
   3. Этапы отбора проб
      1. Откройте клапан зажима для биопсии и медленно переместите его к доминирующей руке. Когда головка щипцов окажется в поле зрения, откройте лоскут зажима и манипулируйте эндоскопом на слизистой оболочке желудка места забора пробы.
      2. Слегка надавите, закройте щипцы для биопсии и зажмите ткань слизистой оболочки желудка (диаметр: 0,5-1 мм, около 5-10 мг/блок). Извлеките образцы тканей с помощью плоскогубцев в пробирке для отбора проб (включая консервационную жидкость), чтобы завершить обработку участка.
      3. Продолжайте завершать отбор проб на других участках и поместите их в ту же пробоотборную пробирку (включая консервационный раствор).
      4. Завершите отбор проб на всех участках, затяните крышку пробоотборной трубки и запечатайте ее, чтобы предотвратить высыхание. Маркируйте пробирки уникальным идентификационным номером на внешней стороне.
      5. Как можно скорее отправьте собранные образцы на тестирование. Не помещайте образцы при комнатной температуре (RT) более чем на 24 часа. Избегайте многократного замораживания и размораживания клинических образцов при транспортировке на дальние расстояния. Если невозможно обеспечить температуру -20 ± 5 °C, транспортируйте их при температуре 0-8 °C. Храните образцы в течение пяти месяцев при температуре -20 ± 5 °C, а при длительном хранении держите их ниже -70 °C.
   4. Профилактика
      1. При заборе материала следует как можно глубже надавить на щипцы для биопсии, чтобы добраться до всего слоя слизистой оболочки.
      2. При извлечении щипцов для биопсии и вскрытии биопсии будьте осторожны, чтобы предотвратить разрыв слизистой оболочки.

2. Экстракция нуклеиновых кислот

1. Заранее отрегулируйте температуру металлической ванны до 100 °C; если образец заморожен, извлеките его и восстановите в RT.
2. Хорошо перемешайте лизат, чтобы суспензировать смолу иминодиуксусной кислоты. Возьмите 100 мкл лизата в центробежную пробирку с фильтрующим элементом или непосредственно добавьте ткань слизистой оболочки желудка в центрифужную пробирку с 200 мкл лизата и перемешайте с помощью вихревых колебаний.
3. Поместите трубку центрифуги в металлическую ванну при температуре 100 °C на 10 минут, затем выньте и охладите до температуры RT.
4. Центрифугируйте при 9500 г в течение 5-10 мин. Осторожно втяните надосадочную жидкость в другую стерилизованную пробирку центрифуги и отметьте ее.
5. Немедленно проведите следующий эксперимент или временно храните его при температуре 4 °C для осмотра.

3. Количественное ПЦР-обнаружение H. pylori и генов лекарственной устойчивости (кларитромицин и хинолоны)

1. Извлеките из комплекта праймерный щуп, смешанный раствор фермента и буфер обнаружения. Растопите все компоненты на льду или 2-8 °C, и перемешайте их с легким встряхиванием и мгновенным центрифугированием на низкой скорости.
2. Смешайте 12,5 мкл детектирующего буфера + 7,0 мкл праймерного зонда + 0,5 мкл раствора фермента. Сначала рассчитайте количество каждого реагента, добавьте в соответствующую объемную центрифужную пробирку, хорошо перемешайте и быстро центрифугируйте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество раствора для ПЦР-реакции должно быть рассчитано с учетом количества тестовых образцов, одного сильного положительного контроля, одного слабого положительного контроля, одного отрицательного контроля и одного отрицательного результата ПЦР.
3. После того, как раствор для реакции ПЦР сконфигурирован, добавьте 20,0 мкл раствора для реакции ПЦР в каждую реакционную лунку ПЦР. Затем добавьте 5,0 мкл нуклеиновой кислоты в лунку для ПЦР-реакции с раствором для ПЦР-реакции. Не добавляйте образец или нуклеиновую кислоту в лунку для отрицательного контроля ПЦР.
4. Поместите реакционную пробирку в флуоресцентный термоамплификатор для ПЦР и установите следующие параметры цикла: сначала нагрейте реакционную смесь при 42 °C и 95 °C в течение 2 минут; во-вторых, денатурировать в течение 10 с при 95 °C, отжечь и продлить на 45 с при 58 °C, повторить в течение 40 циклов.
5. Собирайте флуоресцентные сигналы в виде FAM (мутация гена 23S рРНК), HEX/VIC (мутация гена gyrA ), ROX (H. pylori) и CY5 (внутренний стандарт), а также данные при 58 °C.
6. После реакции сохраните данные и проанализируйте их с помощью специального программного обеспечения для количественной ПЦР.

Результаты

Оценка инфекции H. pylori и антибиотикорезистентности в ткани желудка с помощью количественной ПЦР
Количественно-ПЦР-анализы для идентификации H. pylori проводили путем нацеливания на ген ureA , а устойчивость к антибиотикам опреде...

Обсуждение

Для выявления H. pylori используются традиционные тесты, такие как RUT, UBT, гистология, культивирование, а также серология. Каждый диагностический подход имеет свои преимущества и сталкивается со специфическими проблемами в зависимости от^{клинического конте?...}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Incubator	ALLSHENG	MK2000-2	Provide a constant temperature environment
Biosafety cabinet	Haier	HR1500-B2
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	THERMO ST16R	Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
Chelex-100	sigma	C7901	Resin
Gastroscope biopsy forceps	Boston Scientific Corporation		Sampling of the gastric mucosa
Helicobacter pylori 23S rRNA gene and gyrA gene mutation detection kit	Jiangsu Mole Bioscience	CFDA 20223400137	qPCR detection kit for H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Nucleic acid extraction reagent	Jiangsu Mole Bioscience	SEDA 20150076	For DNA extraction
SDS Software	Applied Biosystems	7300/7500	Data analysis
Thermocylcer	Thermo Fisher Scientific	ABI 7500	For qPCR detection of H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Vortex mixer	JOANLAB	VM-5005	For mixing reagent