Analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi della mucosa gastrica per il rilevamento dell'Helicobacter pylori e della resistenza agli antibiotici

Riepilogo

Un metodo rapido e accurato per il rilevamento di H. pylori e i test di resistenza ai farmaci è molto importante per eradicare efficacemente H. pylori nella pratica clinica. Questo protocollo mira a presentare una metodologia specifica che coinvolge la reazione quantitativa della polimerasi (qPCR) della mucosa gastrica per la rilevazione rapida di H. pylori e della resistenza agli antibiotici.

Abstract

L'Helicobacter pylori è uno dei principali agenti patogeni che infetta quasi la metà della popolazione mondiale e sta minacciando la salute pubblica a causa della sua crescente resistenza agli antibiotici. Inoltre, l'Helicobacter pylori è anche responsabile di gastrite cronica, ulcere gastriche e duodenali, carcinoma gastrico e linfoma del tessuto linfoide associato alla mucosa gastrica (MALT). Pertanto, è essenziale eseguire una diagnosi tempestiva e accurata di H. pylori e la determinazione della sua resistenza agli antibiotici. Al giorno d'oggi, i metodi esistenti per la diagnosi di H. pylori includono principalmente il test rapido dell'ureasi (RUT), il test dell'urea del respiro (UBT), il test degli anticorpi sierici, il test dell'antigene, la gastroscopia e la coltura batterica. Tuttavia, i batteri non potevano essere coltivati attraverso i primi cinque metodi di rilevamento, per non parlare del rilevamento della resistenza ai farmaci. La coltura batterica richiede molto tempo e i test di sensibilità agli antibiotici non possono essere eseguiti rapidamente e di routine. In ambito clinico, l'identificazione rapida e precisa di H. pylori e della sua suscettibilità agli antibiotici è fondamentale per la sua efficace eliminazione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare un approccio mirato che utilizzi la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) su campioni di mucosa gastrica per accelerare la diagnosi di H. pylori e valutare la sua resistenza agli agenti antimicrobici. La qPCR è stata sfruttata per rilevare il gene ureA per l'infezione da H. pylori e le mutazioni nei geni 23S rRNA e gyrA associati alla resistenza alla claritromicina e ai chinoloni, rispettivamente. Attualmente, permangono sfide nella qPCR della mucosa gastrica a causa della mancanza di procedure operative standard. Pertanto, è essenziale condividere le metodologie con i dettagli sperimentali per garantire una comunicazione accurata delle procedure sperimentali, contribuendo a protocolli gold standard che consentono una maggiore trasparenza. Nel complesso, questo protocollo offre un'alternativa economica e rapida ai metodi convenzionali per valutare l'infezione da H. pylori e la sua resistenza agli antibiotici attraverso l'applicazione della tecnologia della reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR).

Introduzione

H. pylori è un batterio gram-negativo che può sopravvivere in presenza di un basso livello di ossigeno. L'organismo appartiene a diverse popolazioni genetiche distinte e mostra un'elevata diversità genetica. Sebbene l'organismo abbia solitamente una forma a spirale, potrebbe essere cambiato in un bastoncino¹. È un agente patogeno principale che infetta quasi il 50% della popolazione mondiale². Per lo più, l'infezione si verifica quando i pazienti rimangono portatori sani durante l'infanzia e i sintomi si manifestano più tardi nell'età adulta. È stato riportato che è relativo alla gastrite cronica, alle ulcere gastriche e duodenali, al carcinoma gastrico e al linfoma del tessuto linfoide associato alla mucosa gastrica (MALT)³. Le differenze nelle manifestazioni dell'infezione da H. pylori potrebbero derivare dagli elementi di patogenicità di ceppi batterici distinti, nonché dagli attributi dell'ospite e dai loro modelli dietetici⁴. La ricerca indica che gli uomini che si dedicano al fumo e al consumo di alcol hanno un rischio maggiore di contrarre infezioni da H. pylori ⁵. L'efficacia dell'eliminazione di H. pylori per la prevenzione del cancro allo stomaco e delle lesioni precancerose è stata verificata in diversi studi ^6,7. Pertanto, l'eradicazione di H. pylori è stata consigliata come misura preventiva dall'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro^{dell'Organizzazione} mondiale della sanità (OMS) 8.

La diagnosi rapida e accurata dell'infezione da H. pylori è una parte fondamentale del trattamento per la maggior parte degli individui che soffrono di dispepsia asintomatica. La diagnosi di H. pylori comporta una combinazione di approcci invasivi e non invasivi. Le tecniche invasive comprendono tipicamente l'endoscopia per la visualizzazione diretta, l'analisi istologica di campioni di tessuto, il test rapido dell'ureasi (RUT) per rilevare l'attività batterica e la coltura dei batteri. D'altra parte, le strategie non invasive comprendono il test del respiro dell'urea (UBT), che misura il metabolismo batterico; il test dell'antigene delle feci (SAT), che rileva le proteine batteriche nelle feci; test sierologici che cercano anticorpi nel sangue; e diagnostica molecolare che utilizza materiale genetico per il rilevamento. Sebbene ciascuno di questi metodi diagnostici abbia i propri vantaggi e svantaggi, nell'ambito della pratica clinica non esiste un unico metodo universalmente riconosciuto come il punto di riferimento definitivo⁹.

Attualmente, il trattamento principale per le infezioni da H. pylori sono gli antibiotici. Tuttavia, le percentuali di successo delle terapie antimicrobiche volte a sradicare l'H. pylori sono in declino, attribuibile a vari fattori. Si sospetta che le cause predominanti dell'inefficacia del trattamento siano la resistenza dei batteri agli agenti antimicrobici e l'aderenza dei pazienti al regime prescritto¹⁰. In particolare, i ceppi di H. pylori resistenti alla claritromicina sono stati oggetto di ricerche approfondite¹¹. L'incidenza di tale resistenza è in aumento in numerose nazioni. La resistenza a H. pylori è dovuta principalmente a mutazioni nel gene della regione variabile dell'rRNA 23S, che causa cambiamenti conformazionali nel ribosoma. Di conseguenza, il sito di legame per la claritromicina cambia, portando a un indebolimento dell'affinità tra H. pylori e claritromicina, impedendo l'inibizione della sintesi proteica batterica¹². È noto che le mutazioni nelle posizioni A2143G, A2142G e A2142C all'interno del segmento di 2,9 kb del gene 23S rRNA conferiscono resistenza alla claritromicina. Anche la diffusione della resistenza ai fluorochinoloni è stata al centro di numerose indagini. Gli studi hanno documentato tassi di resistenza alla levofloxacina al 34,5% in Cina e al 22,1% in Italia¹³. I farmaci chinolonici agiscono principalmente sulla topoisomerasi II di H. pylori inibendo l'attività enzimatica, influenzando la sintesi e la replicazione del DNA e la struttura secondaria, raggiungendo così scopi antibatterici. Se si verificano mutazioni nei geni che codificano per le subunità della topoisomerasi, gyrA e gyrB, impedirà il legame di antibiotici come la levofloxacina e l'enzima, con conseguente incapacità di inibire la replicazione del genoma di H. pylori , causando così resistenza. Tra questi, i punti caldi delle mutazioni nel gene gyrA sono concentrati negli amminoacidi 87 e 91, mentre le mutazioni nel gene gyrB si verificano meno frequentemente e sono spesso accompagnate da mutazioni in gyrA¹⁴. I loci di mutazione del gene di resistenza alla levofloxacina includono principalmente i sei siti di mutazione (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) situati nel gene gyrA. L'identificazione di meccanismi di resistenza derivanti da alterazioni genetiche ha indotto una progressiva transizione nella rilevazione di H. pylori, allontanandosi dai metodi basati sulla coltura verso tecniche diagnostiche molecolari.

UBT e SAT sono i test non invasivi più comunemente scelti, ma non possono fornire informazioni sulla suscettibilità ai farmaci. Di conseguenza, lo sviluppo di una tecnica rapida e completa per rilevare H. pylori e valutare la sua resistenza ai farmaci è fondamentale per la sua efficace eliminazione in ambito clinico¹⁵. Tra le tecniche di rilevamento molecolare, la reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) ha visto progressi significativi. A differenza della PCR standard, la qPCR elimina la necessità di elettroforesi su gel e consente la quantificazione precisa di DNA o RNA incorporando primer e sonde specifici durante la fase di ricottura. I kit qPCR disponibili in commercio offrono ora la capacità di identificare le infezioni da H. pylori e la resistenza ai farmaci¹⁶.

Fondamentalmente, c'è un'immediata necessità clinica di un approccio diagnostico che sia potente e completo, in grado di rilevare le infezioni da H. pylori e valutare contemporaneamente la resistenza ai farmaci. Abbiamo adottato l'analisi qPCR della mucosa gastrica per la rilevazione di H. pylori e la resistenza agli antibiotici utilizzando diverse sonde primer.

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Protocollo

Lo studio esistente è stato condotto in conformità con le considerazioni etiche stabilite dal comitato etico del Guangdong Provincial People's Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Cina (numero di approvazione: KY2024-1115-01). In questo studio sono stati arruolati pazienti di età compresa tra 18 e 60 anni. Per questo studio, i partecipanti sono stati esclusi se avevano recentemente assunto antibiotici, rimedi erboristici antibatterici, inibitori della pompa protonica (PPI) o antagonisti del recettore H₂ nelle 2 settimane precedenti il test. Inoltre, gli individui che si erano sottoposti a terapia anti-H. pylori negli ultimi 3 mesi o quelli con problemi cardiaci, epatici o renali significativi, neuropatia grave o disturbi psichiatrici non erano idonei alla partecipazione. Sono stati esclusi quelli con controindicazioni per l'esame gastroscopico, come perforazione gastrointestinale, età avanzata, segni vitali instabili, ecc. Lo studio inoltre non ha incluso donne in gravidanza o in allattamento. La scheda di consenso informato dei soggetti comprende principalmente i seguenti contenuti: (1) background e finalità della ricerca; (2) Chi non è idoneo a partecipare a questo progetto di ricerca? (3) Quali sono i requisiti per partecipare alla ricerca? (4) Possibili benefici della partecipazione alla ricerca; (5) Possibili reazioni avverse, rischi e disagio; (6) Protezione della privacy; (7) Diritti dell'interessato; (8) Dichiarazione dell'oggetto; (9) Dichiarazione del ricercatore, ecc.

1. Prelievo della mucosa gastrica

1. Preparazione dei materiali di consumo per il campionamento
   1. Preparare il tubo di campionamento contenente la soluzione di conservazione.
   2. Preparare le pinze per biopsia del gastroscopio.
2. Preparazione degli oggetti di campionamento
   1. Raccogli campioni da pazienti con gastrite cronica, ulcera gastrica, ulcera duodenale, cancro gastrico o pazienti sospetti. Raccogliere i campioni mantenendo le procedure asettiche.
      NOTA: I campioni raccolti includevano tessuto mucoso gastrico di pazienti o pazienti sospetti.
   2. Confermare l'anamnesi farmacologica.
      1. Assicurarsi che il paziente non assuma antibiotici e bismuto per H. pylori entro 4 settimane e che non venga assunto alcun inibitore dell'acido entro 2 settimane.
      2. Richiedere ai pazienti che assumono farmaci anticoagulanti (warfarin, aspirina, clopidogrel, ecc.) di interrompere l'assunzione di farmaci per 5-7 giorni.
3. Raccolta di esemplari
   1. Sito di campionamento
      1. In base ai requisiti del nuovo sistema Sydney, prelevare campioni bioptici dall'antro gastrico, dalla curva grande e piccola del corpo gastrico e dall'angolo gastrico (per un totale di 5 punti). I siti specifici sono illustrati nella Figura 1. Una piccola curva del seno pilorico a 2-3 cm dall'anello pilorico (A₁) e una grande curva (A₂); a 4 cm dallo stomaco (B₁) e una grande curva a 8 cm dal cardias (B₂); angolo gastrico (IA).
      2. Secondo il consenso degli esperti sulla standardizzazione della biopsia endoscopica digestiva e dell'esame patologico in Cina (bozza), prelevare campioni di biopsia dal lato piccolo del seno gastrico a 5 cm dal piloro (adiacente all'angolo gastrico) o dal lato grande dell'angolo gastrico (biopsia 1-2 pezzi).
   2. Descrizione del luogo di raccolta dei campioni speciali
      1. Per i pazienti sottoposti a qualsiasi trattamento, dopo un ritiro di 4 settimane, raccogliere contemporaneamente campioni di antro gastrico e corpo gastrico.
      2. Per i pazienti con carcinoma gastrico, raccogliere il tessuto dalla grande curvatura dello stomaco ma non dal tessuto tumorale.
      3. Per i pazienti con ulcere gastriche, raccogliere il tessuto dell'antro gastrico e del bordo dell'ulcera gastrica. Non raccogliere il fondo dell'ulcera.
      4. Per i pazienti con gastrite atrofica, raccogliere l'antro gastrico e il corpo gastrico. Non raccogliere campioni dalle aree di atrofia della mucosa gastrica e metaplasia intestinale.
   3. Fasi di campionamento
      1. Aprire la valvola di bloccaggio della biopsia e spostarla lentamente verso la mano dominante. Quando la testa della pinza si trova nel campo visivo, aprire il lembo di serraggio e manipolare l'endoscopio sulla mucosa gastrica del sito di prelievo.
      2. Applicare una leggera pressione, chiudere la pinza per biopsia e bloccare il tessuto della mucosa gastrica (diametro: 0,5-1 mm, circa 5-10 mg/blocco). Estrarre i campioni di tessuto con le pinze nella provetta di campionamento (compreso il liquido di conservazione) per completare il sito.
      3. Continuare a completare il campionamento di altri siti e posizionarli nella stessa provetta di campionamento (compresa la soluzione di conservazione).
      4. Completare il campionamento di tutti i siti, serrare il coperchio del tubo di campionamento e sigillare per evitare l'essiccazione. Etichettare i tubi con un numero di identificazione univoco all'esterno.
      5. Inviare i campioni raccolti per il test il prima possibile. Non posizionare i campioni a temperatura ambiente (RT) per più di 24 ore. Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti dei campioni clinici durante il trasporto a lunga distanza. Se non è possibile garantire una temperatura compresa tra -20 ± 5 °C, trasportarli a 0-8 °C. Conservare i campioni per un periodo di cinque mesi a una temperatura compresa tra -20 ± 5 °C e, per una conservazione a lungo termine, mantenerli al di sotto di -70 °C.
   4. Precauzioni
      1. Durante il prelievo, premere la pinza per biopsia il più in profondità possibile per raggiungere l'intero strato di mucosa.
      2. Quando si rimuove la pinza per biopsia e si apre la biopsia, prestare attenzione a prevenire lacerazioni della mucosa.

2. Estrazione con acido nucleico

1. Regolare in anticipo la temperatura del bagno metallico a 100 °C; se il campione è bloccato, rimuoverlo e ripristinarlo in RT.
2. Mescolare bene il lisato per sospendere la resina dell'acido iminodiacetico. Prelevare 100 μL di lisato nella provetta centrifuga con l'elemento filtrante, oppure aggiungere direttamente il tessuto della mucosa gastrica nella provetta da centrifuga con 200 μL di lisato e miscelare con l'oscillazione a vortice.
3. Mettere la provetta da centrifuga in un bagno di metallo a 100 °C per 10 minuti, quindi rimuoverla e raffreddarla a RT.
4. Centrifugare a 9500 g per 5-10 min. Aspirare con cautela il surnatante in un'altra provetta da centrifuga sterilizzata e contrassegnarlo.
5. Eseguire immediatamente l'esperimento seguente o conservarlo temporaneamente a 4 °C per l'ispezione.

3. Rilevazione qPCR di H. pylori e geni di resistenza ai farmaci (claritromicina e chinoloni)

1. Rimuovere la sonda di innesco, la soluzione enzimatica mista e il tampone di rilevamento dal kit. Sciogliere tutti i componenti con ghiaccio o 2-8 °C e mescolarli con leggero agitamento e centrifugazione istantanea a bassa velocità.
2. Miscelare 12,5 μl di tampone di rilevamento + 7,0 μl di sonda di primer + 0,5 μl di soluzione enzimatica. Calcolare prima la quantità di ciascun reagente, aggiungerlo alla provetta da centrifuga del volume appropriato, mescolare bene e centrifugare brevemente.
   NOTA: La quantità totale della soluzione di reazione PCR deve essere calcolata includendo il numero di campioni di prova, un controllo positivo forte, un controllo positivo debole, un controllo negativo e un controllo negativo PCR.
3. Dopo aver configurato la soluzione di reazione PCR, aggiungere 20,0 μl della soluzione di reazione PCR a ciascun pozzetto di reazione PCR. Quindi, aggiungere 5,0 μL di acido nucleico al pozzetto della reazione PCR con la soluzione di reazione PCR. Non aggiungere alcun campione o acido nucleico al pozzetto di controllo negativo della PCR.
4. Inserire la provetta di reazione nel termociclatore fluorescente per PCR e impostare i parametri del ciclo come segue: per prima cosa, riscaldare la miscela di reazione a 42 °C e 95 °C per 2 minuti; in secondo luogo, denaturare per 10 s a 95 °C, ricuocere e stendere per 45 s a 58 °C, ripetere per 40 cicli.
5. Raccogli i segnali di fluorescenza come FAM (mutazione del gene 23S rRNA), HEX/VIC (mutazione del gene gyrA ), ROX (H. pylori) e CY5 (standard interno) e dati a 58 °C.
6. Dopo la reazione, salvare i dati e analizzarli utilizzando un software qPCR specifico.

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Risultati

Valutazione dell'infezione da H. pylori e della resistenza agli antibiotici nel tessuto gastrico tramite qPCR
I test qPCR per l'identificazione di H. pylori sono stati condotti prendendo di mira il gene ureA e la resistenza agli antibiotici è stata accertata esaminando mutazioni specifiche nei geni 23S rRNA e gyrA (Tabella 1). I dati di garanzia della qualità, rappresentati dai va...

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Discussione

Per la rilevazione di H. pylori vengono sfruttati test tradizionali come RUT, UBT, istologia, coltura e sierologia. Ogni approccio diagnostico offre vantaggi distinti e affronta sfide specifiche a seconda del contesto clinico¹⁷. La coltivazione di H. pylori da biopsie della mucosa gastrica è spesso considerata il punto di riferimento per la diagnosi. Tuttavia, questo metodo è laborioso e la sua accuratezza è limitata da sfide tecniche, dalle c...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Incubator	ALLSHENG	MK2000-2	Provide a constant temperature environment
Biosafety cabinet	Haier	HR1500-B2
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	THERMO ST16R	Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
Chelex-100	sigma	C7901	Resin
Gastroscope biopsy forceps	Boston Scientific Corporation		Sampling of the gastric mucosa
Helicobacter pylori 23S rRNA gene and gyrA gene mutation detection kit	Jiangsu Mole Bioscience	CFDA 20223400137	qPCR detection kit for H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Nucleic acid extraction reagent	Jiangsu Mole Bioscience	SEDA 20150076	For DNA extraction
SDS Software	Applied Biosystems	7300/7500	Data analysis
Thermocylcer	Thermo Fisher Scientific	ABI 7500	For qPCR detection of H. pylori and drug-resistance genes (clarithromycin and quinolones)
Vortex mixer	JOANLAB	VM-5005	For mixing reagent