Para comenzar la adición del anticuerpo primario, aspire la albúmina sérica bovina o BSA de las células HeLa transfectadas fijas y bloqueadas dejando 10 microlitros de solución BSA en el pozo. Luego agregue 10 microlitros de la solución de anticuerpos primarios preparada en BSA al 3% en PBS e incube la placa en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, enjuague cada pocillo cuatro veces con 100 microlitros de PBS, dejando 10 microlitros después del último lavado.
A continuación, agregue 10 microlitros de solución de anticuerpos secundarios a la placa de pocillos 384. Use anticuerpos específicos de isotipo conjugados con fluorocromos, como Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 555. Después de incubar la placa en la oscuridad durante una hora, enjuague cada pocillo cuatro veces con 100 microlitros de PBS y deje 50 microlitros de PBS en el pozo después del último lavado.
El uso de anticuerpos anti-ADN permitió el monitoreo de la distribución del ADN mitocondrial en la célula bajo las condiciones experimentales dadas. La regulación a la baja del factor de transcripción mitocondrial A TFAM condujo a cambios drásticos en la distribución del ADN mitocondrial con menos manchas de ADN mitocondrial que en las células de control. La cuantificación de la señal fluorescente media del anticuerpo anti-ADN mostró un aumento de varias veces tras el silenciamiento de TFAM en comparación con las otras condiciones probadas.
