Para empezar, inocular 2 millones de células pan02 en 12 mililitros de DMEM, e incubar a 37 grados centígrados y 95% de humedad, 5% de dióxido de carbono y 35% de aire. Después de 48 horas, centrifugue el cultivo a 28 g durante 2 minutos y deseche el sobrenadante. Fije las células añadiendo 1 mililitro de glutaraldehído al 2,5% en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros durante la noche a 4 grados centígrados.
Al día siguiente, centrifugar las muestras a 1006 g durante cinco minutos y aspirar el fijador antes de enjuagar la muestra dos veces con PBS 0,1 molar. Posteriormente, enjuague las muestras dos veces con agua bidestilada durante 10 minutos cada una. A continuación, agregue una solución de 50 microlitros de tetróxido de osmio al 1% y ferrocianuro de potasio al 1,5% en una proporción de 1 a 1 e incube a 4 grados centígrados durante 1 hora.
Centrifugar y enjuagar las muestras dos veces con PBS 0,1 molar y una vez con agua bidestilada. Luego agregue 1 mililitro de tiocarbohidrazida al 1% e incube a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Después de la incubación, centrifugue y deseche el sobrenadante antes de enjuagar las muestras 4 veces con agua bidestilada.
A continuación, agregue 50 microlitros de tetróxido de osmio al 1% y deje que se fije a temperatura ambiente durante 1 hora. Centrifugar de nuevo y enjuagar las muestras 4 veces con agua bidestilada. Agregue 1 mililitro de acetato de uranilo al 2% y deje que se tiña a 4 grados centígrados durante la noche.
Después de enjuagar las muestras con agua bidestilada, agregue 1 mililitro de solución Walton e incube a 60 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, enjuague las celdas 4 veces con agua destilada doble antes de la deshidratación en una serie de etanol graduada durante 10 minutos cada una. Luego deshidratar dos veces en un mililitro de acetona al 100% durante 10 minutos cada una.
A continuación, mezcle 200 microlitros de acetona con resina epoxi Pon 812 en una proporción de 3 a 1, 1 a 1 y 1 a 3. Y remoje las muestras en la resina a temperatura ambiente durante 2, 4 y 4 horas respectivamente Después de la incubación respectiva, impregne las muestras durante la noche en resina epoxi 100% Pon 812. Al día siguiente, transfiera las muestras a un molde de inclusión plano y polimérelas en un horno a 60 grados centígrados durante 48 horas.
Después de la polimerización, utilizando un ultra micrótomo, recoja tiras cortadas en serie de 70 nanómetros de espesor en las obleas de silicio hidrolizadas y séquelas en un horno a 60 grados centígrados durante 10 minutos.
