Corta una cinta de carbón conductora y pégala entre las obleas de silicio montadas con secciones de células pancreáticas y la etapa de muestra SEM. A continuación, ajuste la tensión de aceleración FESEM a dos kilovoltios con una distancia de trabajo de cuatro milímetros. En la barra de menú superior, haga clic en el icono HL.
A continuación, con un aumento bajo, oriente la primera sección de las tiras de corte de destino y, de nuevo, haga clic en el icono HL para cambiar al modo de aumento alto. Recopile una imagen adecuada para la estructura de interés ajustando el brillo, el contraste y la ampliación de la imagen. A continuación, seleccione Vista de proyecto, luego Datos abiertos e importe los archivos de imagen que se analizarán en el software.
Alinee las imágenes haciendo clic en Alinear cortes y Editar. A continuación, en la barra de menú inferior izquierda, ajuste el valor de Rango de intensidad modificando la transparencia de la imagen. Seleccione el módulo Extraer subvolumen y haga clic en los conjuntos de datos alineados para que se ajusten al tamaño de la parte superpuesta de toda la pila.
A continuación, en la subsección de segmentación, seleccione Remuestrear, luego Segmentación y haga clic en Guardar. A continuación, elige el umbral de la varita mágica y el tamaño de la herramienta Pincel para seleccionar el rango correcto. En el menú Selección, haga clic en el icono Agregar para agregar el área seleccionada.
Después de completar la segmentación regional, genere un archivo de imagen siguiendo los mejores resultados para el tamaño del objeto y la resolución de la imagen. Haga clic en Editor de recorte y, en el cuadro Control deslizante virtual, ingrese el número seis. A continuación, en el menú desplegable de la izquierda, haga clic con el botón derecho en el área gris debajo de la subsección Proyecto y seleccione Generar superficie, luego Crear y aplicar.
En el archivo generado, mediante el módulo Vista de superficie, cree la estructura de superficie y la representación 3D. Las imágenes 2D de FESEM revelan que en el grupo de control, las mitocondrias se distribuyeron uniformemente con estructuras de crestas regulares. Por el contrario, el grupo RSL3 mostró mitocondrias reducidas con mayor densidad de membrana y estructuras de crestas vagas.
Sin embargo, no todas las crestas mitocondriales degeneraron en el grupo RSL3, ya que algunas permanecieron intactas. En comparación con el grupo RSL3, el grupo inhibidor tenía estructuras de crestas en su mayoría intactas y solo unas pocas no eran evidentes. Las imágenes en 3D del grupo de control proporcionaron una visión más precisa de las mitocondrias y sus estructuras de crestas.
Las imágenes 3D del grupo RSL3 mostraron mitocondrias irregulares y vacuoladas, mientras que el grupo inhibidor mostró diversas formas de crestas. La cuantificación de las alteraciones mitocondriales mostró que el grupo RSL3 había disminuido significativamente la longitud y el volumen mitocondrial, en comparación con el grupo control, mientras que el grupo inhibidor mostró resultados intermedios. RSL3 también causó disfunción mitocondrial y alteró el metabolismo celular al cambiar la morfología mitocondrial y desencadenar la ferroptosis.
