En el día cero, coloque 10 millones de células 293T en 30 mililitros de DMEM libre de antibióticos que contienen un 10% de FBS en una placa de 15 centímetros. Prepara un total de 10 platos de este tipo. Al día siguiente, que es el primer día, confirme que las células son 80% confluentes y están listas para la transfección.
Luego, en un tubo cónico de 50 mililitros secuencialmente, agregue 600 microlitros de 0,5 microgramos por mezcla de plásmidos de empaque de microlitros y 60 microlitros de biblioteca de códigos de barras de plásmidos. En un tubo cónico separado de 15 mililitros mezcle 900 microlitros de reactivo de transfección y 12 mililitros de DMEM por vórtice. Agregue 12.9 mililitros de esta mezcla a la mezcla de ADN y simplemente mueva para combinar.
Sin mezclar más, incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, gota a gota, agregue 2,5 mililitros de la mezcla incubada a cada plato de 15 centímetros que contenga las células 293T e incube las células durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. En el tercer día, coseche el virus pasando el medio a través de una unidad de filtración de 0,2 micras.
Alicuente el filtrado que contiene partículas virales en tubos cónicos de 15 mililitros. Además, prepare cinco alícuotas de un mililitro de virus filtrado en viales criogénicos para la titulación viral. Para valorar los grupos lentivirales, agregue 65 microlitros de polímero catiónico a un matraz de vidrio estéril que contenga 65 mililitros de medios de crecimiento de células tumorales.
Pipetear un mililitro del medio que contiene el polímero por pocillo en 11 placas de cultivo de tejidos de seis pocillos. A continuación, tripsinar las células tumorales de paso temprano. Después de contar las células con un método preferido, transfiéralas a las placas de seis pocillos.
Descongele las alícuotas de un mililitro del lentivirus de 48 horas del congelador en un baño de agua a 37 grados centígrados. Siga la tabla para preparar la infección para cada módulo viral.
