Para comenzar, coloque los materiales experimentales necesarios en la plataforma de trabajo. Agregue 100 microlitros de solución estéril de gelatina al 0,4% a los pocillos de una placa inferior transparente de 96 pocillos de paredes negras. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos.
Bajo un microscopio invertido, confirme que las células endoteliales en un matraz T75 son 80 a 100% confluentes. Retire el medio completo DMEM del matraz por aspiración. Para lavar las células, agregue 10 mililitros de PBS y agite suavemente el matraz.
Reemplace el PBS con cinco mililitros de solución de disociación celular. Incubar el matraz a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 12 minutos. Golpee el matraz después de seis minutos.
Para ayudar a facilitar la disociación. Añada cinco mililitros del medio completo DMEM precalentado al matraz y mezcle la suspensión de celdas. Con una pipeta serológica de 10 mililitros, transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 50 mililitros y centrifugue a 150 g durante cinco minutos.
Mientras tanto, con una pipeta de pastor conectada a una aspiradora, aspire la solución de gelatina de la placa de 96 pocillos. Después de la centrifugación de las células, retire la supernatina del tubo sin alterar el pellet. Con una pipeta serológica, agregue ocho mililitros de medio completo DMEM fresco al tubo y pipetee suavemente la suspensión para romper la pastilla celular.
Cuente las células usando trippen blue en un hemocitómetro. Agregue el medio completo DMEM para hacer una densidad de 600, 000 celdas por mililitro de suspensión. Mezcle la suspensión celular invirtiendo suavemente el tubo.
Añada la suspensión de celdas a un depósito de pipetas multicanal de 50 mililitros. Cada 30 segundos, balancee suavemente el depósito de lado a lado para mezclar la suspensión y use una pipeta multicanal para agregar 100 microlitros a cada pocillo de la placa de 96 pocillos recubierta con gelatina. Vuelva a colocar la cubierta transparente de la placa y agite suavemente la placa deslizándola sobre la superficie de la campana estéril de norte a sur y de este a oeste.
Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 16 a 24 horas.
