이 연구는 이안 Goodfellow, 그리고 아르 아리아스에게 수여 마리 퀴리 사내 유럽 원정대 (FP7 유럽 연구 협의회)에게 수여 Wellcome 트러스트 수석의 원정대에 의해 후원되었다. 우리는 우리 자신 애질런트의 bioanalyser를 사용할 수있는 권한을 갖게하고 RNA 샘플을 실행에 도움을 주셔서 이오 홍 청, 닥터 레베카 Robey 및 박사 마이크 스키너 감사드립니다.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li><li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses.">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li><li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus.">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5'-end+of+the+genome.">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li><li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection.">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li><li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4.">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).</li><li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5'+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs.">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li><li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase:+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate.">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li><li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs:+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site.">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li><li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components.">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase.">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li><li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA.">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li><li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li><li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo.">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기에서 우리는 세포 배양에서 전염성 MNV의 회복을 허용 서로 다른 두 역방향 유전자 접근 방법을 보여주고있다. 효과적으로 그리고 세포 변이에 의해 인정되는 뒤덮힌 MNV 성적 증명서의 생성을 통해 바이러스성 RNA를 게놈의 5 &#39;끝에 VPg의 covalently 연동을위한 절대적인 요구를 우회 접근 둘 다. 효소 상한 다음에 시험 관내 전사에서 더 효율적이다 성적표가 FPV 상한 효소에 의해 공을 수있는 T7 RNA의 효소를 표현하는 세포에서 전염성 plasmids의 전사보다 전염성 MNV의 회복. 이러한 역방향 유전학 시스템과 복구 바이러스 titres는 감염된 세포 배양 17 (그림 5)에서 정화 바이러스성 VPg 연결된 RNA의 transfection에 의해 얻은 이들과 비슷합니다. 허용 Raw264.7 세포로 덮힌 MNV RNA의 transfection은 transfectio 관련된 실험이 겨우 1-로그 낮은 바이러스 titre를 렌더링N 바이러스성 VPg 연결된 RNA를 (그림 5)가 포함된 감염된 세포로부터 총 RNA의. 이 사실은 이러한 시스템에 의해 생성된 성적의 5 &#39;끝에 VPg 분자의 추가가 VPg에 관련된 세포에 MNV의 감염의 기본 기능적인 측면을 나타낼 수 증가 바이러스 수율 초래할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 추가 조사를 장려한다. 다른 RNA 바이러스에 비해 고효율 하나가 유전 시스템은 현재 체외 베꼈는데 RNA에이 virions 19, 20와 실제 감염에 비해 전용 10-100 낮은 titres의 회복을 허용하는 데 사용 반대로 그럼에도 불구하고, 우리는이 역방향 유전학 시스템을 생각한다. 전체적으로 현재의 방법론은 노로 바이러스 분자 생물학 분야에서 앞으로 중요한 단계를 구성하며, 노로 바이러스의 genomes에서 단백질과 RNA의 보존 작품의 기능적 역할을 조사하는 도구를 제공. 이러한 접근 방식은 이미 C와 결합되어이내 10 일 4, 21의 생쥐 - urrent 마우스 모델 사용 가능하고 MNV은 전염성 cDNA로부터 복구하는 것으로 나타났습니다 정보&gt; 80% STAT1-/ 중 치명적인 감염을 일으킬 수 있습니다. 우리가 capsid 단백질 및 생체내 21, 22에서 다소 감쇠 phenotypes을 표시할 다른 호스트 요인 (PTB와 PCBP)의 바인딩에 관여 polypyrimidine 넓이의 유력한 murine 노로 바이러스의 돌연변이를 회복이 시스템의 활용. 또한, 최근에 다시 세포 배양에 복제 효율적 ORF4에서 VF1 단백질을 표현할 수있는 능력이지만 부족한 바이러스 WT MNV 8 관련하여 생쥐에 독성을 감소 것을 증명하고있다. 이러한 연구는 우리가 잠재적인 백신 후보로 조사 수 MNV 연구를 토대로 인간 noroviruses의 감쇠 버전을 설계하는 것이 좋습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 염화 리튬의 석출 솔루션 </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA 스토리지 솔루션 </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 스크립트 </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap 677은 시스템 상한 </td><td> Epicentre의 Biotechnologies </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> 네온 transfection 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> 네온 transfection 시스템 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM 전 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Transfection 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> 애질런트 RNA 600 나노 키트 </td><td> 애질런트 </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> 애질런트 2100 BIoanalyzer </td><td> 애질런트 </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA와 젤 밴드 정제 키트 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX 대규모 RNA 생산 시스템-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

인간 noroviruses 인간 위장염 (GE) 전 세계의 대부분의 경우에 대한 책임이며, 가까운 사람 대 사람의 접촉이 1, 2를 피할 수없는 환경에서 반복 문제입니다. 지난 몇 년 동안 병원에서 발병의 발병률 증가는 자신의 경영 능력뿐만 아니라, 큰 경제적 손실에 상당한 혼란을 초래보고되었습니다. 새로운 항바이러스 접근 방식의 식별은 세포 배양 3에서 생산적인 감염을 완료하는 인간 noroviruses의 무능력으로 인해 제한되었습니다. 밀접하게 인간의 노로 바이러스 네하지만 어떤 관련이 murine 노로 바이러스 (MNV)의 최근의 분리는 세포 5에서 증식 수있는 이러한 병원균 6, 7의 조사를위한 새로운 길을 열었습니다. 새로운 긍정적인 감각의 게놈과 subgenomic RNA 분자의 합성에 MNV 복제 결과, 후기 지난 생에 해당바이러스 게놈의 RD (그림 1). MNV는 ORF1은 게놈의 대부분을 점유하고 polyprotein 전구체에서 발표된 일곱 비 구조 단백질 (NS1-7) 인코딩 중 네 가지 열린 독서 프레임 (ORFs)를 포함합니다. ORF2 및 ORF3는 subgenomic RNA 지역 내에 포함된 및 capsid 단백질 (각각 VP1과 VP2) (그림 1) 인코딩됩니다. 최근, 우리는 ORF2 중복되는 추가 ORF4을 확인하지만, 색다른 열람 프레임에 기능이며, mitochondrial화된 독성 계수 (VF1) 8을 위해 인코딩했습니다. noroviruses 포함하여 긍정적인 감각 RNA 바이러스, 대한 복제는 새로운 uncapped RNA의 genomes의 합성 결과 세포질에서 이루어진다. 바이러스 번역을 촉진하기 위해 바이러스가 세포의 단백질 합성 기계 9-11을 모집 겨냥한 다양한 전략을 악용. 흥미롭게도, 노로 바이러스 번역은 다기능 바이러스성 단백질 프라이머의 VPg에 의해 주도되고covalently 게놈과 subgenomic RNAs 12-14 모두의 5 &#39;끝에 연결되어. 번역의 이러한 복잡한 메커니즘은 기존의 역방향 유전학 방법에 의한 바이러스 복구의 제한된 효율성의 주요 요소가 될 가능성이 높습니다. 여기 murine 노로 바이러스-1 세대 (이것과 함께 MNV으로 함) 5 &#39;끝에 공을 성적을 바탕으로 두 가지 전략을보고합니다. 두번째 접근법은 T7 RNA 중합 효소의 표현 세포의 cDNA MNV의 해독을 수반하는 반면 방법 중 하나는 체외 합성과 바이러스의 RNA의 상한을 모두 포함합니다. MNV의 연구와 작은 동물 모델에 대한 이러한 역방향 유전학 시스템의 가용성 복제 및 pathogenesis 15-17에서 바이러스 시퀀스의 역할을 해부하기 위해 전례없는 능력을 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Noroviruses들이 특성화를위한 위장염 아직 분자 기술의 주요 원인은 아직 비교적 새로운입니다. 여기 murine 노로 바이러스 (MNV), 세포 배양에서 증식 수있는이 속의 유일한 구성원의 효율적인 복구를위한 두 개의 역방향 유전학 방법을보고합니다.

감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K 조회수.  Imperial College London. Noroviruses들이 특성화를위한 위장염 아직 분자 기술의 주요 원인은 아직 비교적 새로운입니다. 여기 murine 노로 바이러스 (MNV), 세포 배양에서 증식 수있는이 속의 유일한 구성원의 효율적인 복구를위한 두 개의 역방향 유전학 방법을보고합니다.