Agradecemos al Dr. R. Michael Sramkoski ayuda con la citometría de flujo, el Dr. Purnima Jaiswal y el Dr. Wu Di de entrada temprano y Aylyarov Ilya ayuda con las ilustraciones. Apoyado por el NIH Grant R01GM089872 y la Citometría y Microscopia de imágenes facilidad de la base de la sentencia de Centro Integral del Cáncer (P30 CA43703).

1. Crecimiento célula haploide <ol><li> Crecer S. células de Saccharomyces desde el fondo S288C (BY4741) bajo condiciones estándar 10. </li><li> Transformar haploides para expresar cualquiera de los dos marcadores fluorescentes visibles 10. Los marcadores de elección son GFP soluble expresada en el citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado con BglII 11) y una proteína ribosómica único, RPL25, fusionado con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Esperamos que los equivalentes de dos colores protocolos de purificación podría hacer uso de otras proteínas fluorescentes brillantes que son sintetizados por las células parentales haploides. Alternativamente, la pared de la célula podría ser etiquetado con lectinas fluorescentes. </li><li> En la purificación día cigoto anterior, inocular 5 ml de cultivos de cada tipo de células y cultivarlas con agitación durante la noche a 23 ° C para alcanzar A600 no superior a 1,0. Crecer transformantes GFP (ATY4442) en medio sintético completo incluyendo 2% de glucosa (CSM-glucosa) en unand RPL25-mCherry transformantes (ATY4552) en medio sintético selectivo carente de uracilo 10. Mantener cultivos paralelos de cada tipo celular con agitación a temperatura ambiente. </li></ol> 2. La realización de una Cruz <ol><li> Ajuste de la densidad óptica (A600) de cada muestra a 1,0 en medio fresco. [1 Unidad de Densidad Óptica ~ 3 x 10 7 células / ml] </li><li> Mezclar volúmenes iguales de los dos cultivos, vórtice brevemente 3 veces, seguido por un vórtice durante 10 segundos más. </li><li> Preparar glucosa CSM-platos. Las placas son idénticos a los utilizados para el crecimiento de rutina y se han secado 45 min después de verter y solidificación del agar 10. </li><li> Distribuir hasta veinte 40-ml gotitas de la mezcla 1 cm desde el borde de la superficie de placas de glucosa CSM-. Cuando las gotas se aplican primero a la superficie de iniciar el temporizador para medir el tiempo transcurrido. Una vez que el líquido ha sido absorbido (aproximadamente 30 min), cubrir las placas y se dejan en reposo a rootemperatura m. </li></ol> 3. Los preparativos de cosecha <ol><li> Muestras de la cosecha después de 1.75-2.5 horas a 23 ° C mediante lavados repetidos individuales gotas secas de la placa usando 150 ml frío CSM-glucosa, manteniendo las placas en hielo. Repetidamente lave el área gotita 10-20 veces con el mismo medio para maximizar la recuperación. Recoge en 15 ml tubos Falcon en hielo. </li><li> Sonda sonicar las muestras 10 veces a 60% de la amplitud con un sonicador de Fisher FB120 (120Watt, 120 voltios, Frecuencia 20 kHz) en hielo. </li><li> Compruebe en el microscopio de fase que pocos agregados o no permanecen. 15-50% de las células se espera que los cigotos se han formado en este punto. </li><li> Deje el tubo de células en una posición vertical sin perturbaciones en hielo durante 10 min, como medida de precaución adicional (para permitir que los agregados de resolver). </li><li> Recuperar la más alta 90% del volumen y filtrarla a través de una malla de nylon (BD Falcon tubo de polipropileno con tapón tamiz (Ref. 352235)). En un experimento típico, 10 7 célulasse recuperó de una placa eran en este punto se diluyó en 4 ml de CSM-glucosa. </li></ol> 4. Citometría de Flujo <ol><li> Organizar las células utilizando el modelo Sony Reflexión iCyt citómetro de flujo, (Sort paralelo altamente automatizado) HAPS1 con una punta de 100 micras. Para excitación GFP, usar el azul de ion argón, 250 milivatios láser a 488 nm. Por excitación mCherry, utilice el láser de 100 mW a 561 nm. A pesar de que no tienen experiencia con otras máquinas, esperamos que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson afluencia o Beckman Coulter MoFlo XDP estaría bien cuando está equipado con el láser correctas. </li><li> Base parámetros de clasificación en un gráfico de dispersión hacia adelante frente hacia atrás para puerta de células viables. Establecer una parcela de emisión de 615 + / - 30 nm de paso de banda del filtro (mCherry) frente a 525 + / - 25 nm de paso de banda del filtro (GFP) para dividir los eventos en cuatro cuadrantes, &quot;Red + Green-&quot;, &quot;Rojo + Verde +&quot;, &quot;Red- Green-&quot;y&quot; Red-Green + &quot;(Figura S2). Utilice las células no fluorescentes como f estándaro la determinación de la &quot;Rojo-Verde-&quot; cuadrante. </li><li> Clasificar las células con una vaina de presión de 21,5 psi, una frecuencia de gota de 43.400 gotas / seg, y una presión de la muestra de 20,5 psi. </li><li> Ordenar inicial (&quot;modo de recuperación&quot;): Recoger las muestras en tubos Eppendorf refrigerada que contienen 250 ml de frío CSM-glucosa. Sedimento 10 segundos a velocidad máxima en una microcentrífuga refrigerada (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) y aspirar la solución de flujo (citometría de flujo de la solución vaina (PBS con 1 mM EDTA) BioSure Catalog No. 1027). Resuspender en 500 ml frío CSM-glucosa. </li><li> Ordenar Segundo (&quot;Modo de Pureza&quot;): Realizar la especie en cuanto a la clasificación inicial, usando el &quot;modo de pureza&quot; opción. El sedimento. Purificada células y resuspender los gránulos en 500 ml de 1,0-ml CSM-glucosa Agitar durante 15 min en 24-y placas a 23 ° C para permitir la recuperación metabólica. </li></ol> 5. DeltaVision Microscopía <ol><li> Preparar pastillas de agarosa como sigue: Llevar una suspensión de 1,5% de agarosa (UltraPureAgarosa, Invitrogen, n º de catálogo 15510-07) en CSM-glucosa a ebullición, agitar brevemente, y después aplicar 0,3 ml de muestras de la solución de agarosa a la superficie del portaobjetos de vidrio horizontales estándar y los cubre a la vez con una segunda corredera (sin la aplicación de presión). </li><li> Después de enfriar durante 10 min, retirar suavemente la corredera superior deslizándolo horizontalmente, teniendo cuidado de dejar una superficie lisa y no perturbar la capa de agarosa. (Cuando la tapa superior se ha eliminado, la muestra de células se debe aplicar dentro de 1-2 min. Cuando se mantienen en una cámara húmeda a temperatura ambiente sin necesidad de retirar la corredera superior, las almohadillas se pueden almacenar durante hasta un día antes de su uso.) </li><li> Las muestras de sedimentos y depósitos alícuotas de 1 ml del sedimento en las almohadillas de agarosa (sin tocar la superficie). Inmediatamente cubrir la muestra con un cuadrado N º 1 cubreobjetos. Recorte el exceso de agarosa con una hoja de afeitar de un solo filo. Sellar las preparaciones con vaselina dispensados ​​desde una jeringa. </li><li> Imagen con DeltaVision (Applied Precision) con un objetivo de aceite de inmersión 100x sin hurgar en la basura (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolucionar z-pilas utilizando el SoftWorx 5.0.0 del programa ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) y procesar mínimamente. Los sucesivos z aviones fueron recogidos generalmente en intervalos de 0.2-0.4 micrones. </li></ol> 6. Los resultados representativos Los niveles de intensidad de fluorescencia en las células haploides transformadas: El nivel de fluorescencia en los haploides se ilustra en la Figura S1. Antes de la cruz, el examen epifluorescente demostrado que esencialmente todos los transformantes GFP eran verdes y que todos los transformantes mCherry, aunque a menudo débil, eran de color rojo. Para asegurarse de que todas las células utilizadas para la cruz eran de hecho fluorescente, hemos utilizado la subpoblación con la señal fluorescente brillante. Rendimiento: Unespués de la clasificación inicial, el Rojo + Verde muestra + (Figura S2) incluye típicamente 8-20% del número de entrada de células y un número excesivo de células haploides, tal vez debido a la persistente adhesión célula-célula. Desde alto enriquecimiento no se consigue con un solo género, la muestra parcialmente purificada debe ser sonda se sonicaron dos veces a 60% de la amplitud seguido por re-clasificación. (Clases de recuperación suelen durar entre 1-2 horas, mientras que el segundo tipo requiere sólo 15 min.) De las células sometidas a la segunda clase, los Rojo + Verde + muestras incluyen 23-52% de las células de entrada. Examen microscópico Fase: El examen al microscopio de contraste de fases mostró que la pureza de la preparación final de cigoto promedio de aproximadamente 90% más de 21 preparaciones (que van desde 86% a 91%). Los contaminantes eran o bien haploides verde o roja, o pares de haploides que estaban en contacto entre sí. Figura 3 tabula el porcentaje de cigotos que tienensin brote, yemas medial (MED), brotes laterales (Lat) o yemas terminales (Plazo), el número de haploides pares del mismo color (&quot;2Same&quot;) o color diferente (&quot;2Hap&quot;), así como haploides individuales ( Hap). Cuando las células se recogieron después de 1,75 horas, más de 50% fueron unbudded y las otras subcategorías (con yemas medial, lateral o terminal) son igualmente representados. Después de 2,5 horas había aproximadamente el mismo número de cigotos en cada una de las cuatro categorías (unbudded, con cogollos medial, lateral o terminal). Observaciones microscópicas (Figura 4): La estructura de los cigotos parece permanecer sin cambios durante la purificación. De acuerdo a la duración de la cruz, la población tenía diferentes proporciones de cigotos unbudded y reverdeció, como se ha explicado anteriormente. Dado que tanto los haploides verde y rojo mostró una variación considerable en la intensidad de la señal fluorescente, algunos cigotos fueron predominantemente rojo mientras que otros eran predominantemente verde, como se observa por Comparing de las imágenes de un solo color a las imágenes combinadas en la Figura 4. Tenga en cuenta también que la GFP (MW 26kDa) entra en el núcleo y se puede encontrar en el núcleo incluso cuando los núcleos no se han fusionado. Las vacuolas se destacan como negros no fluorescentes esferas. El producto final de purificación permite obtener una población diversa en varias etapas de desarrollo. Los cigotos etiquetados Una fusión no han sido sometidos. Tipo B son cigotos unbudded. Tipo C tienen un pequeño brote. Tipo D tiene un brote más grande, y cigotos tipo E están a punto de someterse a la citocinesis. Tenga en cuenta también que muchos de los cigotos anteriores todavía exhiben una línea no fluorescente división medial (*), y que la vacuolar &quot;estructura de herencia&quot; (I) 12 puede verse a menudo para extenderse desde el cigoto en la yema. En algunos casos, la señal verde se ha redistribuido en la pareja en un grado mucho mayor que la señal roja. Esto refleja el retardo de transferencia que es característico de polisomas (Tartakoff, en preparación). 6 cigotos, que es suficiente para muchos inmunotransferencias, utilizando procedimientos de detección de quimioluminiscencia. Uso de fenol-cloroformo protocolos de aislamiento que extraer aproximadamente 1,5 mg de ARN a partir de este número de células. Puesto que los cigotos purificadas han sido enfriado, antes de un análisis más detallado se recomienda la incubación a 23 ° C en medio de crecimiento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figura 1. Cronología de la formación del cigoto. Cigotos como un intermedio entre haploides y diploides. Este diagrama muestra la activación clásica (shmooing) de haploides, su fusión, y la formación del brote inicial. Brotes puede ser medial (M), lateral (L) o terminal (T). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Esquemática del protocolo de purificación cigoto. Después de la incubación en la superficie de placas de agar en medio completo con la glucosa, la mezcla de células se recuperaron por lavado y después se somete a una clasificación inicial en &quot;modo de recuperación&quot;, seguido de un segundo tipo en el modo de pureza &quot;. &quot; El color amarillo significa que tanto mCherry y señales de GFP fueron visibles en los cigotos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figura 3. Variedades de cigotos en las mezclas de apareamiento fracciones purificadas. Fueron cosechadas después de 1,75 o 2,5 horas para recuperar las fracciones enriquecidas en cigotos relativamente temprana vs relativamente más madura. Ocho experimentos independientes, designados por los distintos colores, se realizaron para cada punto de tiempo. Los gráficos indican el número relativo de cigotos que haVe espacialmente distintos patrones de formación de yemas. Dada la breve duración de la incubación (menos de 2,5 horas a temperatura ambiente) todos los brotes observados son eventos iniciales en ciernes cigóticos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figura 4. DeltaVision examen de fracciones enriquecidas. Un campo típico fue examinado por microscopía DeltaVision. Las ilustraciones muestran bien los colores rojo y verde o individual. El rojo corresponde a la etiqueta polysomal (Rpl25p-mCherry) y el verde a las buenas prácticas agrarias citosólica. Tenga en cuenta el alto enriquecimiento de cigotos, y las características designadas subcelulares: las vacuolas (v), brotes (b), el núcleo (N), vacuolar &quot;estructura de herencia&quot; (i), y la partición (*) que aparece para separar el parental dominios en cigotos relativamente temprana. Su color general variable refleja la intensidad relativa de los haploides que fusionaron. En los casos en que los dos dominios parentales retienenun color distinto, el equilibrio de los marcadores (GFP citoplasmática, mCherry etiquetados con polisomas) era incompleta. Time-lapse estudios en curso muestran que redistribuye solubles GFP antes de polisomas. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . Leyendas complementarias <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Figura S1. La fluorescencia de las células haploides Extremo izquierdo:. Las células que expresan polisomas mCherry-etiquetados fueron examinados para detectar una señal verde. La ventana rectangular se creó para evitar que las células negativas. Medio gráfico: Las células que expresan GFP se analizaron citosólica, que muestra la población mayor claridad brillante de positivos. A la derecha: Las células que expresan polisomas mCherry-etiquetados fueron analizados. El rectángulo (idéntica a la que en el extremo izquierdo) incluye las células más brillantes y permite que todos losnegativos que deben evitarse. La designación &quot;R2&quot; indica el porcentaje de células recuperadas dentro del rectángulo indicado. <img alt="Figura S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figura S2. La distribución de células en la clasificación primero y segundo. Estas parcelas de dos colores indican la proporción de verde + rojo + células en el cuadrante superior derecho (R5). Esta proporción aumenta al 52% en la segunda clase. Eje horizontal: La señal verde. Eje vertical: La señal roja.

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	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La disponibilidad de los cigotos purificados debería facilitar los estudios bioquímicos incluyendo transcriptómica, proteómica y lipidómica, así como la investigación de los mecanismos por los cuales se someten a cigotos ciclo celular de re-entrada, la remodelación de la pared celular, características de florecimiento y la herencia, etc Alternativamente, los cigotos se podría generar a partir con cepas portadoras de mutaciones características en uno o ambos padres. Además, los cigotos purificados, como para ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo / Equipo </td><td> Fuente </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, que codifica GFP citoplasmática 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, RPL25 codificación fusionado a mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicador </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polipropileno tubo con tapa colador </td><td> BD Falcon </td><td> Ref. 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga refrigerada </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> La citometría de flujo vaina solución </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Reflexión iCyt Modelo Citometría de Flujo </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision deconvolución microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de epifluorescencia vertical </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM formulación glucosa Notas: Para las placas de agar, simplemente incluyen 2% de agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Los cigotos son intermediarios esenciales entre haploides y diploides estados en el ciclo de vida de muchos organismos, incluyendo la levadura (Figura 1) 1. S. cerevisiae cigotos resultado de la fusión de células haploides de tipo de apareamiento diferente (MATa, MATalpha) y dan lugar a las correspondientes diploides estables que, sucesivamente, generar tantos como 20 progenie diploide como resultado de sus divisiones mitóticas sorprendentemente asimétricos 2. Formación de cigoto está orquestada por una compleja secuencia de eventos: En este proceso, los factores solubles de acoplamiento se unen a los receptores cognados, provocando mediadas por el receptor cascadas de señalización que facilitan la interrupción del ciclo celular y culminan en la fusión célula-célula. Los cigotos se puede considerar un modelo para progenitor o función de células madre. Aunque se ha aprendido mucho acerca de la formación de cigotos y aunque cigotos se han utilizado para investigar las células moleculares preguntas de interés general sigicance, casi todos los estudios han hecho uso de mezclas de apareamiento en el que los cigotos se entremezclan con una mayoría de la población de células haploides 3-8. Muchos aspectos de la bioquímica de la formación del cigoto y la vida continua del cigoto por lo tanto permanecen sin investigar. Informes de purificación de cigotos levadura describir protocolos basados ​​en sus 9 unidades de sedimentación, sin embargo, este procedimiento sedimentación basada no cedió casi un 90% de pureza en nuestras manos. Además, tiene la desventaja de que las células se exponen a hipertónica sorbitol. Por lo tanto hemos desarrollado un procedimiento de purificación versátil. Para este propósito, pares de células haploides que expresan proteínas fluorescentes rojas o verdes se co-incubaron para permitir la formación de cigoto, se recogieron en diversos momentos, y los zigotos resultantes se purificaron utilizando una citometría de flujo basada en protocolo de clasificación. Esta técnica proporciona una evaluación conveniente visual de la pureza y la maduración. La pureza mediade la fracción es de aproximadamente 90%. De acuerdo con el momento de la cosecha, los cigotos de diferentes grados de madurez se puede recuperar. Las muestras purificadas proporcionar un punto conveniente de partida para &quot;-ómicas&quot; estudios, para la recuperación de la progenie inicial, y para la investigación sistemática de esta célula progenitora.

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Para purificar de cigotos<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Las células haploides de tipo de apareamiento opuesto fueron diseñados para expresar proteínas fluorescentes rojas o verdes, co-incubadas para permitir la formación de cigoto, y se fraccionó utilizando una citometría de flujo basado en el protocolo. La fracción altamente enriquecida permite subsiguiente &quot;-ómicas&quot; los estudios, la recuperación de la progenie inicial y la investigación sistemática de la morfogénesis cigoto.

Citometría de flujo basado Purificación de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Los cigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

12.7K vistas.  Case Western Reserve University School of Medicine. Para purificar de cigotos S. cerevisiae, Las células haploides de tipo de apareamiento opuesto fueron diseñados para expresar proteínas fluorescentes rojas o verdes, co-incubadas para permitir la formación de cigoto, y se fraccionó utilizando una citometría de flujo basado en el protocolo. La fracción altamente enriquecida permite subsiguiente "-ómicas" los estudios, la recuperación de la progenie inicial y la investigación sistemática ...

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Investigación

Biología

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;