Este método que utiliza el concentrado de anticuerpos 22C3 para determinar la expresión de PD-L1 tanto en el tejido tumoral como en la muestra de citología ampliará la capacidad de los laboratorios para evaluar la selección de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas para la inmunoterapia de una manera confiable y reproducible. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente concordante con el ensayo estándar de oro y apoyará pruebas PD-L1 confiables y de alta calidad en todas las regiones de todo el mundo. En general, los patólogos nuevos en este método lucharán debido a la tinción granular observada ocasionalmente.
Además, la tinción de las células humanas es algo más intensa que la observada con el estándar de oro. Por lo tanto, la formación de los patólogos es necesaria para obtener una interpretación correcta de la tinción PD-L1 con el LDT 22C3. Demostrando el procedimiento será la Sra.
Marame Hamila, un técnico de mi laboratorio. Para comenzar, fije el tejido tumoral en formalina 10%con búfer neutro en un cassette e incruste el casete en la parafina como se describe en el protocolo de texto. Incrustar el tejido infiltrado dentro de un molde que está lleno de parafina fundida.
Deje que el tejido permanezca en el molde hasta que la parafina se haya solidificado. Después de esto, utilice un microtoma para secuestrando el tejido incrustado en parafina con un grosor de tres micrómetros. Transfiera la cinta de parafina a un portaobjetos de vidrio cargado positivamente.
Luego, seque el portaobjetos durante una hora a 37 grados Centígrados. En primer lugar, recoger los lavados bronquiales en una solución conservante. Transfiera los lavados a un tubo cónico de 50 mililitros.
Añadir dos gramos de DL-Ditiothreitol y vórtice el tubo durante 30 minutos, luego centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y agregue 10 mililitros de una solución mucolítica. Agitar la muestra a velocidad media durante 20 minutos y centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de esto, retire el sobrenadante y deposite el pellet celular en un tubo de recolección que contenga 10% de formalina neutra. Agregue cuatro gotas de un agente de preparación de bloques de celdas. Transfiera el pellet celular a un casete.
Fijar el pellet celular para la incrustación y sección de parafina utilizando el proceso descrito anteriormente para la preparación de muestras de tejido tumoral. Para empezar, encienda el desatén automático y el ordenador. Haga doble clic en el icono de la opción de detección automática y elija el usuario.
Haga clic en Crear etiqueta y, a continuación, en Protocolo. Haga doble clic en el protocolo 22C3. Rellene la identificación del paciente y haga clic en Imprimir.
Después de esto, pegue la etiqueta en la diapositiva. Pulse el botón del cajón de diapositivas elegido para abrirlo y coloque la diapositiva etiquetada en la almohadilla térmica con la etiqueta hacia arriba y hacia adentro. Cierre el cajón de diapositivas.
A continuación, retire las tapas de los dispensadores. Cargue los reactivos en el bastidor de reactivos. Abra la capucha de la trituradora y coloque los bastidores de reactivos en el carrusel de reactivos, asegurándose de que encajen correctamente y se mantengan en su posición, luego cierre la campana.
En el software, haga clic en el instrumento que se utilizará y, a continuación, haga clic en Ejecutar. Al final del procedimiento IHC, utilice agua del grifo con una sola gota de solución de limpieza para enjuagar el portaobjetos durante varios segundos. Deshidrate la diapositiva sumergiéndola secuencialmente en dos baños de etanol durante varios segundos cada uno, luego coloque la diapositiva en una máquina de cobertura para cargar automáticamente el resbalón de la cubierta.
Para comenzar a evaluar la calidad de la tinción PD-L1, analice los controles positivos y negativos antes de examinar la muestra del paciente. Con un microscopio, confirme la presencia de al menos 100 células tumorales viables. Con un aumento bajo de 4 veces, evalúe todas las áreas tumorales positivas y negativas bien conservadas.
Después de esto, puntúe la tinción parcial o completa de la membrana celular y calcule la puntuación de la proporción tumoral evaluando la proporción de células tumorales PD-L1 positivas en relación con todas las células tumorales presentes en las áreas tumorales bien conservadas. En este estudio, la puntuación de la proporción tumoral o TPS se evalúa para muestras de biopsia de tejido emparejado en bloques de células preparados a partir de lavados bronquiales o derrames pleurales. Los patrones de tinción representativos con muestras de biopsia se utilizan para comparar el concentrado de anticuerpos 22C3 con el ensayo complementario PD-L1 IHC 22C3.
El coeficiente de correlación intraclase, que se utiliza para medir la correlación de la puntuación TPS como una variable continua, es del 99% entre el LDT y el estándar de oro. Los patrones de tinción representativos con muestras de citología también se utilizan para comparar el concentrado de anticuerpos 22C3 con el ensayo complementario PD-L1 IHC 22C3. La tasa de concordancia de las muestras de biopsia y citología con el LDT es superior al 95% cuando se utiliza cualquiera de los puntos de corte del TPS.
El coeficiente de correlación intraclase mientras se utiliza TPS como variable continua está entre 0,88 y 0,90. Una vez dominada, esta técnica proporciona una alta tasa de concordancia con el estándar de oro en la evaluación del límite de positividad o histología tumoral para muestras de tejido y citología. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las muestras deben evaluarse con referencia a la diapositiva HE y en algunos casos difíciles se pueden realizar manchas complementarias para evaluar las células inmunitarias para excluir la interpretación errónea de la expresión PD-L1 solo en las células tumorales.
Tras este procedimiento, se pueden evaluar otros especímenes como biopsias de aguja fina, EUS-FNA o cepillos bronquiales. Después de su establecimiento en las clínicas, la solidez del ensayo debe mantenerse a lo largo del tiempo buscando la acreditación, siguiendo los procedimientos operativos estándar y participando regularmente en esquemas externos de evaluación de la calidad. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo implementar el protocolo optimizado usando el 22C3 anti-PD-L1 concentrado en un autotainer IHC ampliamente disponible tanto muestras de biopsia como de citología de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.
