Diese Methode, mit der das 22C3-Antikörperkonzentrat zur Bestimmung der PD-L1-Expression sowohl in Tumorgewebe als auch in zytologischer Probe verwendet wird, wird die Fähigkeit von Laboratorien erweitern, die Auswahl von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs für die Immuntherapie zuverlässig und reproduzierbar zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sehr gut mit dem Goldstandard-Assay kordatet und zuverlässige, qualitativ hochwertige PD-L1-Tests über Regionen weltweit hinweg unterstützt. Im Allgemeinen werden Pathologen, die neu in dieser Methode sind, wegen der gelegentlich beobachteten granularen Färbung kämpfen.
Darüber hinaus ist die Färbung der menschlichen Zellen etwas intensiver als die, die mit dem Goldstandard beobachtet wird. Daher ist die Ausbildung von Pathologen notwendig, um eine korrekte Interpretation der PD-L1-Färbung mit dem 22C3 LDT zu erhalten. Frau wird das Verfahren demonstrieren.
Marame Hamila, ein Techniker aus meinem Labor. Fixieren Sie zunächst das Tumorgewebe in 10% neutral gepuffertem Formalin in einer Kassette und betten Sie die Kassette in Paraffin ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Betten Sie das infiltrierte Gewebe in eine Form ein, die mit geschmolzenem Paraffin gefüllt ist.
Lassen Sie das Gewebe in der Form bleiben, bis das Paraffin verfestigt ist. Danach verwenden Sie ein Mikrotome, um das paraffinierte Gewebe mit einer Dicke von drei Mikrometern zu schneiden. Übertragen Sie das Paraffinband auf ein positiv geladenes Glasmikroskopschlitten.
Dann trocknen Sie die Rutsche für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Zuerst die Bronchialwäsche in einer Konservierungslösung sammeln. Übertragen Sie die Waschungen auf ein 50-Milliliter-Konustube.
Fügen Sie zwei Gramm DL-Dithiothreitol und Wirbel das Rohr für 30 Minuten, dann Zentrifuge bei 250 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 Milliliter einer Mukolytiklösung hinzu. Schütteln Sie die Probe mit mittlerer Geschwindigkeit für 20 Minuten und Zentrifuge bei 250 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Danach den Überstand entfernen und das Zellpellet in ein Sammelrohr legen, das 10% neutral gepuffertes Formalin enthält. Fügen Sie vier Tropfen eines Zellblockpräparationsmittels hinzu. Übertragen Sie das Zellpellet auf eine Kassette.
Fixieren Sie das Zellpellet für Paraffineinbettung und Schnitte mit dem zuvor beschriebenen Verfahren zur Vorbereitung von Tumorgewebeproben. Schalten Sie zunächst den Autostainer und den Computer ein. Doppelklicken Sie auf das Autostainer-Symbol und wählen Sie den Benutzer aus.
Klicken Sie auf Label erstellen und dann auf Protokoll. Doppelklicken Sie auf das 22C3-Protokoll. Geben Sie die ID des Patienten ein, und klicken Sie auf Drucken.
Danach kleben Sie das Etikett auf die Folie. Drücken Sie die Taste auf der gewählten Schiebeschublade, um sie zu öffnen, und platzieren Sie die beschriftete Folie auf dem Thermopad mit dem Etikett nach oben und innen. Schließen Sie die Schublade.
Entfernen Sie als Nächstes die Kappen aus den Spendern. Die Reagenzien auf das Reagenzien-Rack legen. Öffnen Sie die Kapuze des Flecks und legen Sie die Reagenzienregale auf das Reagenzienkarussell, um sicherzustellen, dass sie richtig passen und in Position halten, und schließen Sie dann die Kapuze.
Klicken Sie in der Software auf das verwendete Instrument und dann auf Ausführen. Verwenden Sie am Ende des IHC-Verfahrens Leitungswasser mit einem einzigen Tropfen Reinigungslösung, um die Rutsche für einige Sekunden zu spülen. Dehydrieren Sie den Schlitten, indem Sie ihn für jeweils mehrere Sekunden sequenziell in zwei Ethanolbäder eintauchen, und legen Sie ihn dann in eine Abdeckungsrutschmaschine, um den Deckelschlupf automatisch zu laden.
Um mit der Bewertung der Qualität der PD-L1-Färbung zu beginnen, analysieren Sie die positiven und negativen Kontrollen, bevor Sie die Patientenprobe untersuchen. Bestätigen Sie mit einem Mikroskop das Vorhandensein von mindestens 100 lebensfähigen Tumorzellen. Bei einer geringen Vergrößerung von 4 mal, bewerten Sie alle gut erhaltenen positiven und negativen Tumorbereiche.
Danach punkten Sie teilweise oder vollständig Zellmembranfärbung und berechnen sie den Tumoranteil, indem Sie den Anteil der PD-L1-positiven Tumorzellen relativ zu allen Tumorzellen in den gut erhaltenen Tumorbereichen bewerten. In dieser Studie wird der Tumoranteil score oder TPS für gepaarte Gewebebiopsieproben in Zellblöcken ausgewertet, die aus Bronchial-Washes oder Pleuraergüssen hergestellt werden. Repräsentative Färbemuster mit Biopsieproben werden verwendet, um das 22C3-Antikörperkonzentrat mit dem PD-L1 IHC 22C3 Begleittest zu vergleichen.
Der intraklassale Korrelationskoeffizient, der verwendet wird, um die Korrelation des TPS-Scores als kontinuierliche Variable zu messen, beträgt 99 % zwischen dem LDT und dem Goldstandard. Repräsentative Färbemuster mit zytologischen Proben werden auch verwendet, um das 22C3-Antikörperkonzentrat mit dem PD-L1 IHC 22C3 Begleittest zu vergleichen. Die Konkordanzrate von Biopsie- und Zytologieproben mit dem LDT beträgt mehr als 95 %, wenn man einen der TPS-Schnittpunkte verwendet.
Der intraklassale Korrelationskoeffizient bei Verwendung von TPS als fortlaufender Variable liegt zwischen 0,88 und 0,90. Einmal gemeistert, gibt diese Technik eine hohe Übereinstimmungsrate mit dem Goldstandard bei der Bewertung der Cutoff für Positivität oder Tumorhistologie für Gewebe- und Zytologie-Proben. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Proben in Bezug auf das HE-Dia bewertet werden müssen und in einigen schwierigen Fällen ergänzende Flecken zur Beurteilung von Immunzellen durchgeführt werden können, um eine Fehlinterpretation der PD-L1-Expression nur in Tumorzellen auszuschließen.
Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Proben wie Feinnadelbiopsien, EUS-FNAs oder Bronchialbürsten ausgewertet werden. Nach der Einstellung in den Kliniken muss die Robustheit des Assays im Laufe der Zeit aufrechterhalten werden, indem die Akkreditierung beantragt wird, standardbetriebliche Verfahren befolgt werden und regelmäßig an externen Qualitätsbewertungssystemen teilgenommen wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das optimierte Protokoll mit dem 22C3 Anti-PD-L1-Antikörper implementieren können, konzentrieren sich auf einen weit verbreiteten IHC-Autostainer sowohl Biopsie- als auch Zytologieproben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.
