Este método utilizando o concentrado de anticorpos 22C3 para determinar a expressão PD-L1 tanto no tecido tumoral quanto na citologia expandirá a capacidade dos laboratórios de avaliar a seleção de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas para imunoterapia de forma confiável e reprodutível. A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente concordante com o ensaio padrão-ouro e suportará testes PD-L1 confiáveis e de alta qualidade em todas as regiões do mundo. Em geral, os patologistas novos neste método lutarão por causa da coloração granular ocasionalmente observada.
Além disso, a coloração das células humanas é um pouco mais intensa do que a observada com o padrão-ouro. Portanto, a formação de patologistas é necessária para obter a interpretação correta da coloração PD-L1 com o LDT 22C3. Demonstrando o procedimento será a Sra.
Marame Hamila, um técnico do meu laboratório. Para começar, fixe o tecido tumoral em formalina tamponada 10% neutra em uma fita e incorpore a fita em parafina conforme descrito no protocolo de texto. Incorpore o tecido infiltrado dentro de um molde cheio de parafina derretida.
Deixe o tecido ficar no molde até que a parafina se solidifique. Depois disso, use um microtome para secionar o tecido embutido na parafina em uma espessura de três micrômetros. Transfira a fita de parafina para um slide de microscópio de vidro carregado positivamente.
Em seguida, seque o escorregador por uma hora a 37 graus Celsius. Primeiro, recolher as lavagens brônquias em uma solução conservante. Transfira as lavagens para um tubo cônico de 50 mililitros.
Adicione dois gramas de DL-Dithiothreitol e vórtice do tubo por 30 minutos, depois centrífuga a 250 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Remova o supernatante e adicione 10 mililitros de uma solução mucóltica. Agite a amostra em velocidade média por 20 minutos e centrífugue a 250 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente.
Depois disso, remova o supernatante e deposite a pelota da célula em um tubo de coleta contendo formalina 10% neutra. Adicione quatro gotas de um agente de preparação de blocos de células. Transfira a cápsula da célula para uma fita.
Fixar a pelota celular para incorporação e secção de parafinas usando o processo descrito anteriormente para o preparo de amostras de tecido tumoral. Para começar, ligue o auto-tainer e o computador. Clique duas vezes no ícone de auto-tainer e escolha o usuário.
Clique em Criar rótulo e, em seguida, em Protocolo. Clique duas vezes no protocolo 22C3. Preencha a ID do paciente e clique em Imprimir.
Depois disso, coloque a etiqueta no slide. Pressione o botão na gaveta de slides escolhida para abri-lo e coloque o slide rotulado na almofada térmica com a etiqueta voltada para cima e para dentro. Feche a gaveta de slides.
Em seguida, remova as tampas dos distribuidores. Carregue os reagentes no rack de reagentes. Abra o capô do manchador e coloque os racks de reagente no carrossel de reagentes, certificando-se de que eles se encaixam corretamente e mantenham a posição, em seguida, feche o capô.
No software, clique no instrumento que será usado e clique em Executar. No final do procedimento IHC, use água da torneira com uma única gota de solução de limpeza para enxaguar o slide por vários segundos. Desidrate o slide, imergindo-o sequencialmente em dois banhos de etanol por vários segundos cada, em seguida, coloque o slide em uma máquina de cobertura para carregar automaticamente o deslizamento da tampa.
Para começar a avaliar a qualidade da coloração PD-L1, analise os controles positivos e negativos antes de examinar a amostra do paciente. Usando um microscópio, confirme a presença de pelo menos 100 células tumorais viáveis. Com baixa ampliação de 4 vezes, avalie todas as áreas tumorais positivas e negativas bem preservadas.
Depois disso, escore a coloração parcial ou completa da membrana celular e calcule o escore de proporção do tumor avaliando a proporção de células tumorais PD-L1 positivos em relação a todas as células tumorais presentes nas áreas tumorais bem preservadas. Neste estudo, o escore de proporção do tumor ou TPS é avaliado para amostras de biópsia de tecido pareado em blocos de células preparados a partir de lavagens brônquicas ou derrames pleurais. Padrões representativos de coloração com amostras de biópsia são usados para comparar o concentrado de anticorpos 22C3 com o ensaio companheiro PD-L1 IHC 22C3.
O coeficiente de correlação intraclasse, utilizado para medir a correlação do escore TPS como variável contínua, é de 99% entre o LDT e o padrão-ouro. Padrões representativos de coloração com amostras de citologia também são usados para comparar o concentrado de anticorpos 22C3 com o ensaio companheiro PD-L1 IHC 22C3. A taxa de concordância das amostras de biópsia e citologia com o LDT é superior a 95% ao usar qualquer um dos pontos de corte do TPS.
O coeficiente de correlação intraclasse, utilizando O TPS como variável contínua, está entre 0,88 e 0,90. Uma vez dominada, esta técnica dá uma alta taxa de concordância com o padrão-ouro na avaliação do corte para positividade ou histologia tumoral para espécimes de tecido e citologia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as amostras devem ser avaliadas com referência ao slide he e, em alguns casos difíceis, manchas complementares para avaliar células imunes podem ser realizadas para excluir a má interpretação da expressão PD-L1 apenas em células tumorais.
Após este procedimento, outras amostras como biópsias de agulha fina, EUS-FNAs ou escovas brônquicas podem ser avaliadas. Após sua fixação nas clínicas, a robustez do ensaio precisa ser mantida ao longo do tempo, buscando credenciamento, seguindo procedimentos operacionais padrão e participando regularmente de esquemas externos de avaliação da qualidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implementar o protocolo otimizado usando o anticorpo anti-PD-L1 22C3 concentrado em um autostainer IHC amplamente disponível, tanto amostras de biópsia quanto de citologia de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas.
