Questo metodo che utilizza il concentrato di anticorpi 22C3 per determinare l'espressione di PD-L1 sia nel tessuto tumorale che nel campione di citologia amplierà la capacità dei laboratori di valutare la selezione di pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole per l'immunoterapia in modo affidabile e riproducibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente concorde con il saggio gold standard e supporterà test PD-L1 affidabili e di alta qualità in tutte le regioni del mondo. In generale, i patologi nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della colorazione granulare osservata occasionalmente.
Inoltre, la colorazione delle cellule umane è un po 'più intensa di quella osservata con il gold standard. Pertanto la formazione dei patologi è necessaria per ottenere una corretta interpretazione della colorazione PD-L1 con il 22C3 LDT. A dimostrare la procedura sarà la signora
Marame Hamila, una tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, fissare il tessuto tumorale in formalina tamponata al 10% in una cassetta e incorporare la cassetta in paraffina come delineato nel protocollo di testo. Incorporare il tessuto infiltrato all'interno di uno stampo riempito con paraffina fusa.
Lasciare che il tessuto rimanga nello stampo fino a quando la paraffina non si è solidificata. Successivamente, utilizzare un microtomo per sessare il tessuto incorporato nella paraffina a uno spessore di tre micrometri. Trasferire il nastro di paraffina su uno scivolo al microscopio in vetro caricato positivamente.
Quindi, asciugare lo scivolo per un'ora a 37 gradi Celsius. In primo luogo, raccogliere i lavaggi bronchiali in una soluzione conservante. Trasferire i lavaggi in un tubo conico da 50 millilitri.
Aggiungere due grammi di DL-Ditiothreitol e vortice il tubo per 30 minuti, quindi centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 millilitri di una soluzione mucolitica. Agitare il campione a media velocità per 20 minuti e centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, rimuovere il supernatante e depositare il pellet cellulare in un tubo di raccolta contenente formalina tamponata al 10% neutra. Aggiungere quattro gocce di un agente di preparazione del blocco cellulare. Trasferire il pellet di cella su una cassetta.
Fissare il pellet cellulare per l'incorporamento e la sessatura della paraffina utilizzando il processo precedentemente descritto per la preparazione di campioni di tessuto tumorale. Per iniziare, accensione dell'autostainer e del computer. Fare doppio clic sull'icona del rilevamento automatico e scegliere l'utente.
Fare clic su Crea etichetta e quindi su Protocollo. Fare doppio clic sul protocollo 22C3. Compilare l'ID del paziente e fare clic su Stampa.
Successivamente, attaccare l'etichetta sulla diapositiva. Premere il pulsante sul cassetto diapositiva scelto per aprirlo e posizionare la diapositiva etichettata sul pad termico con l'etichetta rivolta verso l'alto e verso l'interno. Chiudere il cassetto scorrevole.
Quindi, rimuovere i tappi dai distributori. Caricare i reagenti sul rack dei reagenti. Aprire il cofano della scala e posizionare i rack dei reagenti sulla giostra dei reagenti, assicurandosi che si adattino correttamente e si tengano in posizione, quindi chiudere il cofano.
Nel software, fare clic sullo strumento che verrà utilizzato e quindi fare clic su In esecuzione. Al termine della procedura IHC, utilizzare l'acqua del rubinetto con una singola goccia di soluzione detergente per risciacquare il vetrino per diversi secondi. Disidratare lo scivolo immergendolo in sequenza in due bagni di etanolo per diversi secondi ciascuno, quindi posizionare lo scivolo in una macchina di copertura per caricare automaticamente lo slittamento del coperchio.
Per iniziare a valutare la qualità della colorazione PD-L1, analizzare i controlli positivi e negativi prima di esaminare il campione del paziente. Utilizzando un microscopio, confermare la presenza di almeno 100 cellule tumorali vitali. Con un basso ingrandimento di 4 volte, valuta tutte le aree tumorali positive e negative ben conservate.
Successivamente, segnare la colorazione parziale o completa della membrana cellulare e calcolare il punteggio della proporzione tumorale valutando la proporzione di cellule tumorali PD-L1 positive rispetto a tutte le cellule tumorali presenti nelle aree tumorali ben conservate. In questo studio, il punteggio di proporzione tumorale o TPS viene valutato per campioni di biopsia dei tessuti accoppiati in blocchi di cellule preparati da lavaggi bronchiali o effusioni pleuriche. I modelli di colorazione rappresentativi con campioni di biopsia vengono utilizzati per confrontare il concentrato di anticorpi 22C3 con il saggio complementare PD-L1 IHC 22C3.
Il coefficiente di correlazione intraclasse, che viene utilizzato per misurare la correlazione del punteggio TPS come variabile continua, è del 99% tra l'LDT e il gold standard. Modelli di colorazione rappresentativi con campioni di citologia vengono utilizzati anche per confrontare il concentrato di anticorpi 22C3 con il saggio complementare PD-L1 IHC 22C3. Il tasso di concordanza dei campioni di biopsia e citologia con l'LDT è superiore al 95% quando si utilizza uno dei punti di taglio TPS.
Il coefficiente di correlazione intraclasse durante l'utilizzo di TPS come variabile continua è compreso tra 0,88 e 0,90. Una volta padroneggiata, questa tecnica dà un alto tasso di concordanza con il gold standard nel valutare il cutoff per positività o istologia tumorale sia per i campioni di tessuto che per i ciclici. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i campioni devono essere valutati con riferimento alla diapositiva HE e in alcuni casi difficili possono essere eseguite macchie complementari per valutare le cellule immunitarie per escludere un'interpretazione errata dell'espressione PD-L1 solo nelle cellule tumorali.
Seguendo questa procedura, è possibile valutare altri campioni come biopsie ad ago fine, EUS-FNA o spazzole bronchiali. Dopo la sua impostazione nelle cliniche, la robustezza del saggio deve essere mantenuta nel tempo cercando l'accreditamento, seguendo procedure operative standard e partecipando regolarmente a schemi esterni di valutazione della qualità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come implementare il protocollo ottimizzato utilizzando l'anticorpo anti-PD-L1 22C3 concentrato su un autostainer IHC ampiamente disponibile sia campioni di biopsia che di citologia da pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole.
