هذه الطريقة باستخدام الأجسام المضادة 22C3 التركيز لتحديد التعبير PD-L1 في كل من أنسجة الورم وعينة الخلايا سوف توسع قدرة المختبرات على تقييم اختيار المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة غير صغير الخلايا للعلاج المناعي بطريقة موثوقة وقابلة للتكرار. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها متطابقة للغاية مع معيار الذهب المقايسة وسوف تدعم موثوق بها، عالية الجودة PD-L1 اختبار في جميع أنحاء العالم. بشكل عام ، سيكافح أخصائيو الأمراض الجدد في هذه الطريقة بسبب التلطيخ الحبيبي الملاحظ أحيانًا.
وعلاوة على ذلك، تلطيخ الخلايا البشرية هو إلى حد ما أكثر كثافة من تلك التي لوحظت مع معيار الذهب. ولذلك فإن تدريب أخصائيي الأمراض ضروري للحصول على تفسير صحيح لتلوين PD-L1 مع 22C3 LDT. إثبات الإجراء سيكون السيدة
(مارام هاميلا)، فني من مختبري. للبدء، إصلاح أنسجة الورم في 10٪ محايد-buffered formalin في كاسيت وتضمين الكاسيت في البارافين كما هو مبين في بروتوكول النص. تضمين الأنسجة المتسللة داخل القالب الذي هو مليئة البارافين المنصهر.
دع الأنسجة تبقى في القالب حتى يتوطد البارافين. بعد ذلك، استخدم ميكروتوم لقسم الأنسجة المدمجة البارافين بسمك ثلاثة ميكرومتر. نقل الشريط البارافين إلى شريحة المجهر الزجاجي المشحونة بشكل إيجابي.
ثم جفف الشريحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أولاً ، اجمع غسيل الشعب الهوائية في محلول حافظ. نقل الغسيل إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
إضافة غرامين من DL-Dithiothreitol ودوامة الأنبوب لمدة 30 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 250 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة عظمى وإضافة 10 ملليلتر من محلول المخاطي. هز العينة بسرعة متوسطة لمدة 20 دقيقة وطاردة مركزية عند 250 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، إزالة عظمى وإيداع بيليه الخلية في أنبوب جمع تحتوي على 10٪ محايد-buffered formalin. إضافة أربع قطرات من خلية عامل إعداد كتلة. نقل بيليه الخلية إلى كاسيت.
إصلاح بيليه الخلية لالبارافين تضمين والقسم باستخدام العملية التي سبق وصفها لإعداد عينات أنسجة الورم. للبدء، الطاقة على الـ autostainer والكمبيوتر. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز autostainer واختيار المستخدم.
انقر على إنشاء تسمية ثم على بروتوكول. انقر نقراً مزدوجاً على بروتوكول 22C3. املأ بطاقة هوية المريض وانقر على طباعة.
بعد ذلك، ضع التسمية على الشريحة. اضغط على الزر الموجود على درج الشريحة المختار لفتحه ووضع الشريحة المسماة على الوسادة الحرارية مع الملصق الذي يواجه الصعود و إلى الداخل. أغلق درج الشريحة.
بعد ذلك، إزالة القبعات من موزعات. تحميل الكواشف على رف الكواشف. افتح غطاء محرك السيارة من البقعة ووضع رفوف الكاشف على الكواشف، والتأكد من أنها تناسب بشكل صحيح وعقد في الموقف، ثم إغلاق غطاء محرك السيارة.
في البرنامج، انقر على الصك الذي سيتم استخدامه ثم انقر فوق تشغيل. في نهاية الإجراء IHC، استخدام مياه الصنبور مع قطرة واحدة من محلول التنظيف لشطف الشريحة لعدة ثوان. يجفف الشريحة عن طريق غمرها بشكل متسلسل في حمامين من الإيثانول لعدة ثوانٍ لكل منهما، ثم ضع الشريحة في آلة أغطية لتحميل زلة الغطاء تلقائيًا.
للبدء في تقييم نوعية تلطيخ PD-L1 ، قم بتحليل الضوابط الإيجابية والسلبية قبل فحص عينة المريض. باستخدام المجهر، تأكد من وجود ما لا يقل عن 100 خلية ورم قابلة للحياة. في التكبير منخفضة من 4 مرات، وتقييم جميع المناطق الورم الإيجابي والسلبي الحفاظ عليها بشكل جيد.
بعد ذلك، يسجل غشاء الخلية الجزئي أو الكامل تلطيخ وحساب درجة نسبة الورم عن طريق تقييم نسبة خلايا الورم PD-L1 إيجابية نسبة إلى جميع الخلايا السرطانية الموجودة في مناطق الورم المحفوظة بشكل جيد. في هذه الدراسة، يتم تقييم درجة نسبة الورم أو TPS لعينات خزعة الأنسجة المقترنة في كتل الخلايا المعدة من يغسل الشعب الهوائية أو الانصباب الجنبي. يتم استخدام أنماط تلطيخ تمثيلية مع عينات خزعة لمقارنة تركيز الأجسام المضادة 22C3 ضد اختبار مرافق PD-L1 IHC 22C3.
معامل الارتباط بين الطبقة، والذي يستخدم لقياس الارتباط من نقاط TPS كمتغير مستمر، هو 99٪ بين LDT ومعيار الذهب. كما تستخدم أنماط تلطيخ تمثيلية مع عينات الخلايا لمقارنة 22C3-الأجسام المضادة التركيز ضد PD-L1 IHC 22C3 مصاحبة المقايسة. معدل التوافق من عينات خزعة وعلم الخلايا مع LDT هو أكبر من 95٪ عند استخدام أي من نقاط قطع TPS.
معامل الارتباط بين الطبقة أثناء استخدام TPS كمتغير مستمر بين 0.88 و 0.90. مرة واحدة يتقن, هذه التقنية يعطي معدل التوافق عالية مع معيار الذهب في تقييم قطع للإيجابية أو علم الأنسجة الورم لكل من الأنسجة وعينات الخلايا. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أنه يجب تقييم العينات مع الإشارة إلى الشريحة HE وفي بعض الحالات الصعبة يمكن تنفيذ البقع التكميلية لتقييم الخلايا المناعية لاستبعاد سوء تفسير التعبير PD-L1 في الخلايا السرطانية فقط.
بعد هذا الإجراء، يمكن تقييم عينات أخرى مثل خزعات الإبرة الدقيقة، EUS-FNAs أو فرش الشعب الهوائية. بعد وضعها في العيادات، يجب الحفاظ على قوة الفحص مع مرور الوقت من خلال السعي للحصول على الاعتماد، باتباع إجراءات التشغيل الموحدة، والمشاركة بانتظام في خطط تقييم الجودة الخارجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ بروتوكول الأمثل باستخدام 22C3 المضادة PD-L1 التركيز على السيارات IHC المتاحة على حد سواء عينات خزعة وعلم الخلايا من المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة.
