Este protocolo morfométrico permite el seguimiento de la intensidad de la contracción y re-expansión del blastocisto durante las intervenciones previas de vitrificación y la recuperación posterior al calentamiento y proporciona información sobre la eficacia de los métodos de vitrificación del virus. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a laboratorios de fertilización in vitro equipados con microscopios de lapso de tiempo y ordenadores con software avanzado de edición de imágenes. En el día cinco o seis de expansión, someter un blastocisto con al menos unas pocas células de masa celular interna y un trofctodermo cohesivo a un pulso láser de 0,4 a 0,7 milisegundos con un diámetro de agujero que oscila entre 4,3 y 9,4 micrómetros tangencialmente dirigidos a la zona pellucida y la unión de dos células trofódermamosas adyacentes.
Luego, deje que el blastocólico se derrumbe total o parcialmente durante cinco minutos. A continuación, utilice una pequeña pipeta para añadir asépticamente el medio de equilibrio en los orificios del área de microdroplet de una placa petri de nueve poquitos, especialmente diseñada para la microscopía y grabación de lapso de tiempo. Cuando se haya añadido todo el medio, superponga el área de las microgotas con aproximadamente 30 microlitros de medio de equilibrio.
Y sumerja el blastocisto tratado con láser en el medio de equilibrio en la parte inferior de un pozo de microdroplet de la antena de microdroplet. Tan pronto como se transfiera el blastocisto, inicie un temporizador de cuenta regresiva durante 10 minutos. Y transfiera el plato de microdroplet en el escenario de un microscopio equipado con cámara.
Con un aumento de 200 X, ajuste la antena para microdropletas para que el blastocisto se coloque aproximadamente en el centro de la ventana de grabación. A continuación, comience a grabar con el software de grabación del microscopio observando el tiempo de cuenta atrás en el que se inicia la grabación. Para almacenar el blastocisto, después de cargar el embrión en una pajita de vitrificación, selle la paja y sumerja la paja en nitrógeno líquido entre 80 y 110 segundos de carga, antes de colocar el blastocisto en 196 grados celsius negativos.
Para medir el área transversal del blastocisto monitoreado durante la fase de equilibrio, coloque el marcador de herramienta de selección rápida dentro del blastocisto hasta que toque el borde del blastocisto y mantenga pulsado repetidamente el botón izquierdo del ratón para delinear el borde exterior del blastocisto hasta que se haya seleccionado toda el área transversal del blastocisto. A continuación, en la ventana de línea de tiempo, haga clic en el registro de medición y registre las mediciones. Para la re-expansión del blastocisto, transfiera rápidamente la paja del VHS con el blastocisto vitrificado del almacenamiento a un depósito portátil lleno de nitrógeno líquido.
Y usa fórceps para levantar la paja lo suficientemente alta como para exponer la varilla de manipulación de color. Utilice una destripadora de alambre autoajustada para cortar la paja a la altura de la varilla de manipulación de color. Y extraiga la varilla de manipulación de la paja con un movimiento controlado rápido.
Sumerja inmediatamente la espátula curva de la varilla de manipulación en un recipiente de 37 grados Celsius solución de descongelación. Y gire suavemente la varilla de manipulación para separar el blastocisto. Después de un minuto, lave el blastocisto con inmersiones secuenciales de cuatro minutos y solución de dilución.
Lavado de la solución uno, y la solución de lavado dos. A continuación, transfiera el blastocisto calentado a un plato de cuatro pozos que contenga un medio de recuperación fresco y use una pipeta para lavar el blastocisto en las tres gotas de medio. Después del último lavado, transfiera el blastocisto a un plato de lapso de tiempo de nueve pozos, que contiene un medio de recuperación.
Y coloque el plato de nueve pozos bajo una cámara de lapso de tiempo en una incubadora de 37 grados Celsius, 6%CO2 y 5%O2. Ahora, abra el software de grabación de lapso de tiempo y seleccione una cámara de grabación. Seleccione el modo en vivo y coloque el cursor en la imagen.
Desplázate para ampliar la imagen y usa el botón izquierdo del ratón para colocar el pozo que contiene el blastocisto en el centro de la pantalla. En el enfoque, utilice las flechas para enfocar el plano de grabación del blastocisto y bajo intensidad de luz, establezca la intensidad de la luz de la imagen. Haga clic en Parámetros del microscopio para establecer el tiempo de exposición y la gamma, y haga clic en cerrar el modo en vivo.
Haga clic en Iniciar proyecto para introducir los datos del proyecto. Seleccione el tipo de plato de cultivo y desactive todas las posiciones excepto la que se va a grabar. A continuación, establezca el tiempo de captura para tomar una foto cada cinco minutos y haga clic en aprobar para registrar la re-expansión del blastocisto durante al menos 150 minutos.
En este embrión intacto, monitoreado continuamente, el blastocisto intacto no colapsó por completo en la solución de equilibrio y se volvió a expandir a aproximadamente el 70% del tamaño original, después de 10 minutos de exposición a la solución de equilibrio. Por el contrario, este blastocisto colapsado artificialmente se vació completamente del blastocó inmediatamente después del tratamiento con láser y no se observó una re-expansión significativa durante los 10 minutos de exposición a la solución de equilibrio. Tras el tratamiento con medio de vitrificación, que contiene una alta concentración de crioprotectores, este blastocisto intacto equilibrado se sometió a una reducción escalonada del blastocólico.
Después del calentamiento, se volvió a expandir de nuevo al exponerse al medio de recuperación. Este blastocisto pulsado por láser, sin embargo, demostró un colapso inmediato del blastocólo tras el tratamiento con el láser, que no se recuperó durante los pasos de equilibrio o vitrificación, poniendo en duda la necesidad de una fase de equilibrio tan larga para los blastocistos colapsados. El protocolo también da una idea de la capacidad de los blastocistos para recuperar blastocólico después del calentamiento.
Por ejemplo, la re-expansión de blastocólo después del calentamiento puede ser lineal, o puede ser interrumpida con varias contracciones más grandes o más pequeñas. Al intentar este procedimiento es importante recordar que los embriones deben permanecer en la parte inferior de la placa de petri durante la grabación, durante el menor tiempo posible. No olvides que las altas concentraciones de crioprotectores pueden ser tóxicas para los embriones.
Después de cada desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la criobiología, exploraran la eficacia de los protocolos de criopreservación en un programa de fertilización in vitro.
