Este protocolo morfométrico permite o monitoramento da intensidade do encolhimento e re-expansão do blastocisto durante intervenções de vitrificação prévia e recuperação pós-aquecimento e fornece insights sobre a eficácia dos métodos de vitrificação do vírus. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada a laboratórios de fertilização in vitro equipados com microscópios e computadores com software avançado de edição de imagens. No quinto ou sexto dia de expansão, sujeito um blastocisto com pelo menos algumas células de massa celular interna e um trofederme coeso a um pulso laser de 0,4 a 0,7 milissegundos com um diâmetro de furo variando de 4,3 a 9,4 micrômetros tangencialmente direcionados à zona pellucida e a junção de duas células troefitodérmicas adjacentes.
Em seguida, deixe o blastocoel entrar em colapso total ou parcialmente por cinco minutos. Em seguida, use uma pipeta minúscula para adicionar atipo de equilíbrio nos orifícios da área de microdroplet de uma placa de petri de nove poços, especialmente projetada para microscopia e gravação de lapso de tempo. Quando todo o meio tiver sido adicionado, sobreponha a área de microdroplet com aproximadamente 30 microliters de meio de equilíbrio.
E submergir o blastocisto tratado a laser no meio de equilíbrio na parte inferior de um poço de microdroplet do prato de microdroplet. Assim que o blastocisto for transferido, inicie um temporizador de contagem regressiva por 10 minutos. E transfira o prato de microdroplet no palco de um microscópio equipado com câmera.
Usando uma ampliação de 200 X, ajuste o prato de microdroplet para que o blastocisto seja posicionado aproximadamente no centro da janela de gravação. Em seguida, comece a gravar com o software de gravação de microscópio observando o tempo de contagem regressiva em que a gravação é iniciada. Para armazenar o blastocisto, depois de carregar o embrião em uma palha de vitrificação, selar a palha, e mergulhar a palha em nitrogênio líquido entre 80 e 110 segundos de carga, antes de colocar o blastocisto em 196 graus Celsius negativo.
Para medir a área transversal do blastocisto monitorado durante a fase de equilíbrio, posicione o marcador de ferramenta de seleção rápida dentro do blastocisto até que ele toque a borda do blastocisto e clique repetidamente e segure o botão do mouse esquerdo para delinear a borda externa do blastocisto até que toda a área transversal do blastocisto tenha sido selecionada. Em seguida, na janela da linha do tempo, clique no registro de medição e registre as medidas. Para a reestruturação do blastocisto, transfira rapidamente a palha do HSV com o blastocisto vitrificado do armazenamento para um reservatório portátil cheio de nitrogênio líquido.
E use fórceps para levantar a palha alto o suficiente para expor a vara de manuseio colorida. Use uma stripper de arame auto-ajustante para cortar a palha na altura da haste de manuseio colorida. E extrair a haste de manuseio da palha com um movimento controlado rápido.
Mergulhe imediatamente a espátula curva da haste de manuseio em um recipiente de solução de descongelamento de 37 graus Celsius. E gire suavemente a vara de manuseio para desapegar o blastocisto. Após um minuto, lave o blastocisto com imersões sequenciais de quatro minutos e solução de diluição.
Solução de lavagem um, e solução de lavagem dois. Em seguida, transfira o blastocisto aquecido para um prato de quatro poços contendo meio de recuperação fresco e use uma pipeta para lavar o blastocisto em todas as três gotas de médio. Após a última lavagem, transfira o blastocisto para um prato de nove poços, contendo meio de recuperação.
E coloque o prato de nove poços sob uma câmera de lapso de tempo em uma incubadora de 37 graus Celsius, 6%CO2 e 5%O2. Agora, abra o software de gravação de lapso de tempo e selecione uma câmera de gravação. Selecione o modo ao vivo e coloque o cursor na imagem.
Role para ampliar a imagem e use o botão esquerdo do mouse para posicionar o poço que contém o blastocisto no meio da tela. Em foco, use as setas para focar o plano de gravação do blastocisto e sob intensidade de luz definir a intensidade da luz da imagem. Clique nos parâmetros do microscópio para definir o tempo de exposição e o gama e clique no modo de fechar ao vivo.
Clique em iniciar o projeto para inserir os dados do projeto. Selecione o tipo de prato de cultura e desmarque todas as posições, exceto a que deve ser registrada. Em seguida, defina o tempo de captura para tirar uma foto a cada cinco minutos e clique em aprovar para gravar a reestruturação blastocyst por pelo menos 150 minutos.
Neste representante, continuamente monitorado, embrião intacto, o blastocisto intacto não entrou em colapso completamente na solução de equilíbrio e se re expandiu para cerca de 70% do tamanho original, após 10 minutos de exposição à solução de equilíbrio. Em contraste, este blastocisto artificialmente colapsado foi completamente esvaziado do blastocoel imediatamente após o tratamento a laser e nenhuma reexe expansionização significativa foi observada durante os 10 minutos de exposição à solução de equilíbrio. Após o tratamento com meio de vitrificação, contendo uma alta concentração de crioprotetores, este blastocisto intacto equilibrado sofreu uma redução passo-wise do blastocoel.
Após o aquecimento, ele se expandiu novamente após a exposição ao meio de recuperação. Este blastocisto pulsado a laser, no entanto, demonstrou um colapso imediato do blastocoel após o tratamento com o laser, que não foi recuperado durante os passos de equilíbrio ou vitrificação, trazendo em questão a necessidade de uma fase de equilíbrio tão longa para blastocistos colapsados. O protocolo também dá uma visão da capacidade dos blastocistos para recuperar o blastocoel após o aquecimento.
Por exemplo, a reestrutura do blastocoel após o aquecimento pode ser linear, ou pode ser interrompida com várias contrações maiores ou menores. Ao tentar este procedimento é importante lembrar que os embriões devem permanecer no fundo da placa de petri durante a gravação, pelo menor tempo possível. Não se esqueça que altas concentrações de crioprotetores podem ser tóxicas para embriões.
Após cada desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da criobiologia, explorarem a eficácia dos protocolos de criopreservação em um programa de fertilização in vitro.
