Questo protocollo morfometrico consente il monitoraggio dell'intensità del restringimento e della espansione della blastocista durante i precedenti interventi di vetrificazione e recupero post-riscaldamento e fornisce informazioni sull'efficacia dei metodi di vetrificazione dei virus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a laboratori di fecondazione in vitro dotati di microscopi time-lapse e computer con software avanzato di editing delle immagini. Il quinto o sei giorno di espansione, sottopose una blastocista con almeno poche celle di massa cellulare interne e un trophectoderm coeso a un impulso laser da 0,4 a 0,7 millisecondi con un diametro del foro che va da 4,3 a 9,4 micrometri tangenzialmente diretti alla zona pellucida e alla giunzione di due cellule trophectodermal adiacenti.
Quindi, lasciare che il blastocoel collassi completamente o parzialmente per cinque minuti. Successivamente, utilizzare una piccola pipetta per aggiungere aseticamente un mezzo di equilibrazione nei fori dell'area della microdroplet di una piastra di Petri a nove pozzetti, appositamente progettata per la microscopia e la registrazione time-lapse. Quando tutto il mezzo è stato aggiunto, sovrapporre l'area della microdroplet con circa 30 microlitri di mezzo di equilibrazione.
E immergere la blastocista trattata al laser nel mezzo di equilibrazione nella parte inferiore di un pozzo di microgocciolet della piastra di microgocciolet. Non appena la blastocista viene trasferita, avvia un conto alla rovescia per 10 minuti. E trasferire la parabola della microdroplet sul palco di un microscopio dotato di fotocamera.
Utilizzando un ingrandimento di 200 X, regolare la parabola della microdroplet in modo che la blastocista sia posizionata approssimativamente al centro della finestra di registrazione. Quindi, inizia a registrare con il software di registrazione al microscopio notando il tempo di conto alla rovescia in cui viene avviata la registrazione. Per conservare la blastocista, dopo aver caricato l'embrione in una paglia di vetrificazione, sigillare la paglia e immergere la paglia nell'azoto liquido tra 80 e 110 secondi di carico, prima di posizionare la blastocista a -196 gradi Celsius.
Per misurare l'area di sezione trasversale della blastocista monitorata durante la fase di equilibrazione, posizionare il marcatore dell'utensile di selezione rapida all'interno della blastocista fino a tocchi il bordo della blastocista e fare ripetutamente clic e tenere premuto il pulsante sinistro del mouse per delineare il bordo esterno della blastocista fino a quando non è stata selezionata l'intera area di sezione trasversale della blastocista. Quindi, nella finestra della sequenza temporale, fare clic sul registro di misurazione e registrare le misurazioni. Per la rielezione della blastocista, trasferire rapidamente la paglia HSV con la blastocista vetrificata dallo stoccaggio a un serbatoio portatile pieno di azoto liquido.
E usa le forcep per sollevare la paglia abbastanza in alto da esporre l'asta di manipolazione colorata. Utilizzare una spogliarellista di filo autore regolante per tagliare la paglia all'altezza dell'asta di movimentazione colorata. Ed estrarre l'asta di movimentazione dalla paglia con un rapido movimento controllato.
Immergere immediatamente la spatola curva dell'asta di movimentazione in un contenitore di soluzione di scongelamento di 37 gradi Celsius. E ruotare delicatamente l'asta di movimentazione per staccare la blastocista. Dopo un minuto, lavare la blastocista con immersioni sequenziali di quattro minuti e soluzione di diluizione.
Soluzione di lavaggio uno e soluzione di lavaggio due. Successivamente, trasferire la blastocista riscaldata in un piatto di quattro po 'contenente mezzo di recupero fresco e utilizzare una pipetta per lavare la blastocista in tutte e tre le gocce di mezzo. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la blastocista su un piatto a nove tempi di lasso di tempo, contenente mezzo di recupero.
E posizionare il piatto dei nove pomp po' sotto una telecamera time-lapse in un incubatore di 37 gradi Celsius, 6%CO2 e 5%O2. Ora apri il software di registrazione time-lapse e seleziona una fotocamera di registrazione. Selezionare la modalità live e posizionare il cursore sull'immagine.
Scorrere per ingrandire l'immagine e utilizzare il pulsante sinistro del mouse per posizionare il pozzo contenente la blastocista al centro dello schermo. Durante la messa a fuoco, utilizzare le frecce per mettere a fuoco il piano di registrazione della blastocista e sotto l'intensità della luce impostare l'intensità luminosa dell'immagine. Fare clic sui parametri del microscopio per impostare il tempo di esposizione e la gamma e fare clic su Chiudi modalità live.
Fare clic su Avvia progetto per immettere i dati del progetto. Selezionare il tipo di piatto delle impostazioni cultura e deselezionare tutte le posizioni ad eccezione di quella da registrare. Quindi, imposta i tempi di acquisizione per scattare una foto ogni cinque minuti e fai clic su approva per registrare la espansione della blastocista per almeno 150 minuti.
In questo embrione rappresentativo, costantemente monitorato e intatto, la blastocista intatta non è crollata completamente nella soluzione di equilibrazione e si è ri-espansa a circa il 70% della dimensione originale, dopo 10 minuti di esposizione alla soluzione di equilibrazione. Al contrario, questa blastocista collassata artificialmente è stata completamente svuotata del blastocoel subito dopo il trattamento laser e non è stata osservata alcuna espansione significativa durante i 10 minuti di esposizione alla soluzione di equilibrazione. Dopo il trattamento con mezzo di vetrificazione, contenente un'alta concentrazione di crioprotettivi, questa blastocista intatta equilibrata ha subito una riduzione graduale del blastocoel.
Dopo il riscaldamento, si è nuovamente espanso dopo l'esposizione al mezzo di recupero. Questa blastocista pulsata al laser, tuttavia, ha dimostrato un collasso immediato del blastocoel al momento del trattamento con il laser, che non è stato recuperato durante le fasi di equilibrazione o vetrificazione, mettendo in discussione la necessità di una fase di equilibrazione così lunga per le blastocista collassate. Il protocollo fornisce anche informazioni sulla capacità delle blastocista di recuperare il blastocoel dopo il riscaldamento.
Ad esempio, la espansione del blastocoel dopo il riscaldamento può essere lineare o può essere interrotta con diverse contrazioni più grandi o più piccole. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che gli embrioni devono rimanere sul fondo della piastra di Petri durante la registrazione, per il meno tempo possibile. Non dimenticare che alte concentrazioni di crioprotettivi possono essere tossiche per gli embrioni.
Dopo ogni sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della criobiologia, per esplorare l'efficacia dei protocolli di crioconservazione in un programma di fecondazione in vitro.
