Bu morfometrik protokol, blastosist büzülmesi ve önceki vitrifikasyon girişimleri ve ısınma sonrası iyileşme sırasında yeniden genişleme yoğunluğunun izlenmesine olanak sağlar ve virüs vitrifikasyon yöntemlerinin etkinliğine ilişkin bilgiler sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, hızlandırılmış mikroskoplar ve gelişmiş görüntü düzenleme yazılımı na sahip bilgisayarlarla donatılmış in vitro fertilizasyon laboratuvarlarına uygulanabilmektir. Genişleme nin beşinci veya altıncı gününde, en az birkaç iç hücre kitle hücresi ve 0,4 ila 0,7 milisaniyelik lazer darbesine, 4,3 ila 9,4 mikrometre arasında değişen bir delik çapı nazı pellucida ve iki bitişik trophectodermal hücrenin birleştiği noktada bir blastosist konu.
Daha sonra, blastokokun tamamen veya kısmen beş dakika boyunca çökmesine izin verin. Daha sonra, dokuz kuyulu petri kabının mikrodroplet alanının deliklerine denge ortamı eklemek için küçük bir pipet kullanın, hızlandırılmış mikroskopve kayıt için özel olarak tasarlanmıştır. Ortamın tamamı eklendiğinde, mikrodroplet alanını yaklaşık 30 mikrolitre equilibration medium ile kaplayın.
Ve lazerle tedavi edilen blastosisti, mikrodroplet çanağının bir mikrodroplet kuyusu altındaki denge ortamına batırın. Blastosist transfer edilir etmez, 10 dakika geri sayım sayıcı başlatın. Ve mikrodroplet çanasını kamera donanımlı bir mikroskopun sahnesine aktarın.
200 X büyütme kullanarak, blastosistkayıt penceresinin yaklaşık merkezinde konumlandırılmış böylece mikrodroplet çanak ayarlayın. Daha sonra, kaydın başlatıldıği geri sayım süresini belirten mikroskop kayıt yazılımı ile kaydetmeye başlayın. Blastosisti depolamak için, embriyoyu vitrifikasyon pipetine yükledikten sonra, pipeti kapatın ve blastosisti negatif 196 santigrat dereceye yerleştirmeden önce saman ları 80 ila 110 saniye arasında sıvı nitrojene batırın.
Dengeleme aşamasında izlenen blastosistin kesit alanını ölçmek için, blastosistin kenarına değene kadar hızlı seçim aracı işaretçisini blastosistin kenarına yerleştirin ve blastosistin tüm kesit alanı seçilene kadar patlamacının dış kenarını ana hatletmek için sol fare düğmesini tekrar tekrar tıklayın ve basılı tutun. Ardından, zaman çizelgesi penceresinde, ölçüm günlüğünü tıklatın ve ölçümleri kaydedin. Blastosistin yeniden genişlemesi için, vitrifiye blastosist ile HSV samanını depodan sıvı nitrojen dolu taşınabilir rezervuara hızlı bir şekilde aktarın.
Ve renkli taşıma çubuğunu ortaya çıkaracak kadar yüksek olan pipetleri kaldırmak için forseps kullanın. Renkli taşıma çubuğunun yüksekliğinde saman kesmek için kendi kendine ayarlanan bir tel striptizci kullanın. Ve hızlı bir kontrollü hareket ile saman işleme çubuğu ayıklayın.
Hemen 37 santigrat derece eritme çözeltisi bir konteyner içine taşıma çubuğu kavisli spatula dalma. Ve yavaşça blastosist ayırmak için taşıma çubuğu girdap. Bir dakika sonra blastosisti sıralı dört dakikalık daldırma ve seyreltme çözeltisi ile yıkayın.
Bir çözeltiyi yıkamak ve iki çözeltiyi yıkamak. Daha sonra, taze iyileşme ortamı içeren dört kuyu çanak içine Sıcak blastosist aktarın ve orta her üç damla blastosist yıkamak için bir pipet kullanın. Son yıkamadan sonra blastosisti, iyileşme ortamı içeren dokuz iyi zaman atlamalı tabağa aktarın.
Ve 37 derece santigrat, % 6 CO2 ve% 5 O2 kuluçka bir zaman atlamalı kamera altında dokuz iyi çanak yerleştirin. Şimdi, hızlandırılmış kayıt yazılımını açın ve bir kayıt kamerası seçin. Canlı modu seçin ve imleci görüntünün üzerine yerleştirin.
Görüntüyü büyütmek için kaydırın ve ekranın ortasında blastosist içeren kuyuyu konumlandırmak için sol fare düğmesini kullanın. Odaklama altında, blastosistin kayıt düzlemine odaklanmak için okları kullanın ve ışık yoğunluğu altında görüntünün ışık yoğunluğunu ayarlayın. Pozlama süresini ve gama'yı ayarlamak için mikroskop parametrelerini tıklatın ve canlı modu kapat'ı tıklatın.
Proje verilerini girmek için projeyi başlat'ı tıklatın. Kültür çanak türünü seçin ve kaydedilecek pozisyon dışında tüm pozisyonların denetimini kaldırın. Ardından, her beş dakikada bir fotoğraf çekmek için yakalama zamanlamasını ayarlayın ve blastosistin yeniden genişlemesini en az 150 dakika kaydetmek için onayla'yı tıklatın.
Bu temsilci, sürekli olarak izlenen, bozulmamış embriyo, bozulmamış blastosist tamamen denge çözeltisi çökmedi ve yeniden orijinal boyutun yaklaşık% 70 genişletildi, denge çözeltisine maruz kalma 10 dakika sonra. Buna karşılık, bu yapay çökmüş blastosist lazer tedavisinden hemen sonra blastokok tamamen boşaltıldı ve denge çözeltisine maruz kalma 10 dakika boyunca önemli bir yeniden genişleme gözlenmedi. Yüksek oranda kriyoprotektif içeren vitrifikasyon aracı ile tedavi edilen bu dengede olmayan blastosist, blastokokin adım adım azalmasına neden oldu.
Isındıktan sonra, geri kazanım ortamına maruz kaldıktan sonra tekrar genleşti. Ancak bu lazer darbeli blastosist, lazer le tedavi sırasında blastokokanında ani bir çöküş gösterdi, bu denge veya vitrifikasyon adımları sırasında kurtarılamadı, çökmüş blastosistler için böyle uzun bir denge fazı gerekliliğini sorgulayan. Protokol ayrıca blastosistlerin ısınmadan sonra blastokokları kurtarma yeteneği hakkında bilgi verir.
Örneğin, ısınma dan sonra blastokok yeniden genleşme doğrusal olabilir, ya da birkaç büyük veya daha küçük kasılmalar ile kesilebilir. Bu prosedürü denerken, embriyoların kayıt sırasında petri kabının altında mümkün olduğunca kısa bir süre kalması gerektiğini unutmamak gerekir. Yüksek miktarda kriyoprotektifin embriyolar için toksik olabileceğini unutmayın.
Her gelişmeden sonra, bu teknik kriyobiyoloji alanında araştırmacılar için, bir in vitro fertilizasyon programında kriyopreservation protokollerin etkinliğini keşfetmek için yol açtı.
