Этот морфометрический протокол позволяет контролировать интенсивность усадки бластоцист и повторного расширения во время предыдущих мероприятий витрификации и пост-потепления восстановления и дает представление об эффективности методов витрификации вируса. Основным преимуществом этого метода является то, что он может быть применен к лабораториям экстракорпорального оплодотворения, оснащенным покадровые микроскопы и компьютеры с передовым программным обеспечением для редактирования изображений. На пятый или шестой день расширения, при условии бластоцист, по крайней мере несколько внутренних клеток массы клеток и сплоченной trophectoderm на 0,4 до 0,7 миллисекундного лазерного импульса с диаметром отверстия в диапазоне от 4,3 до 9,4 микрометра касательно направлены на zona pellucida и соединение двух смежных трофикодермальных клеток.
Затем, дайте бластокоэлю полностью или частично рухнуть в течение пяти минут. Далее используйте крошечную пипетку, чтобы асептически добавить эквилибровку среды в отверстия области микродроплета из девяти хорошо Петри блюдо, специально предназначенные для замедленной микроскопии и записи. Когда все среды были добавлены, наложить микроdroplet области с примерно 30 микролитров эквилибрации среды.
И погрузите обработанный лазером бластоцист в эквилибруциацию среды в нижней части одного микродроплета хорошо микроdroplet блюдо. Как только бластоцист переносится, запустите таймер обратного отсчета в течение 10 минут. И перенести блюдо из микродроплета на сцену микроскопа, оборудованного камерой.
Используя увеличение 200 X, отрегулируйте блюдо из микродроплета так, чтобы бластоцист расположен примерно в центре окна записи. Затем начните запись с помощью микроскопа, записывающего программное обеспечение, по которому начинается обратный отсчет времени записи. Для хранения бластоцист, после загрузки эмбриона в витрификации соломы, печать соломы, и погрузить солому в жидкий азот между 80 до 110 секунд загрузки, прежде чем поместить бластоцист на отрицательный 196 градусов по Цельсию.
Для измерения поперечной области контролируемых бластоцист во время фазы эквилибрации, положение быстрого выбора инструмент маркера внутри бластоцист, пока он не коснется края бластоцист и неоднократно нажмите и удерживайте левую кнопку мыши, чтобы наметить внешний край бластоцист до тех пор, пока весь поперечный области бластоцист был выбран. Затем, в окне временной шкалы, щелкните журнал измерений и заместите измерения. Для расширения бластоцист быстро перенесите соломинку HSV с витифицированным бластоцистом из хранилища в заполненный жидким азотом портативный резервуар.
И использовать типсы, чтобы поднять солому достаточно высоко, чтобы разоблачить цветные стержня обработки. Используйте саморегулируемую проволоку стриптизерши, чтобы вырезать солому на высоте цветного стержня обработки. И извлечь стержень из соломы с быстрым контролируемым движением.
Немедленно окунитесь изогнутый шпатель стержня обработки в контейнер 37 градусов по Цельсию оттаивания раствора. И осторожно закружить стержень для отсоединеть бластоцист. Через минуту вымойте бластоцист последовательными четырехминутными погружениями и раствором разбавления.
Стиральный раствор один, а стиральный раствор два. Далее, передача разогретого бластоцист в четыре хорошо блюдо, содержащее свежие среды восстановления и использовать пипетку для мытья бластоцист во всех трех капель среды. После последней стирки перенесите бластоцист на девяти хорошо замедливное блюдо, содержащее восстановительную среду.
И поместите девять хорошо блюдо под промежуток времени камеры в 37 градусов по Цельсию, 6%CO2 и 5%O2 инкубатор. Теперь откройте программное обеспечение для записи замедленного действия и выберите камеру записи. Выберите режим в реальном времени и поместите курсор на изображение.
Прокрутите, чтобы увеличить изображение и использовать левую кнопку мыши, чтобы распоидать колодец, содержащий бластоцист в середине экрана. При фокусировке используйте стрелки, чтобы сфокусировать плоскость записи бластоцистки и при интенсивности света установить интенсивность света изображения. Нажмите параметры микроскопа, чтобы установить время экспозиции и гамма, и нажмите близко живой режим.
Нажмите стартовый проект, чтобы ввести данные проекта. Выберите тип блюда культуры и контролируть все позиции, кроме одной, которая будет записана. Затем установите время захвата, чтобы сделать фотографию каждые пять минут и нажмите утвердить для записи blastocyst повторного расширения, по крайней мере 150 минут.
В этом репрезентативном, непрерывно отслеживаемом, нетронутом эмбрионе, нетронутый бластоцист не рухнул полностью в эквилибрации раствора и вновь расширился примерно до 70% от первоначального размера, после 10 минут воздействия эквилибрового раствора. В отличие от этого, этот искусственно рухнул бластоцист был полностью очищен от бластокела сразу после лазерной обработки и никакого значительного повторного расширения не наблюдалось в течение 10 минут воздействия эквилибрации раствора. После лечения витрификации среды, содержащей высокую концентрацию криопротекторов, это уравновешенный нетронутым бластоцист претерпел шаг за шагом сокращение бластокела.
После потепления, он вновь расширен снова при воздействии восстановления среды. Этот лазерно-импульсный бластоцист, однако, продемонстрировал немедленный коллапс бластоцеля при лечении лазером, который не был восстановлен во время эквилибрации или витрификации шаги, в результате чего под сомнение необходимость такой долгой фазы эквилибрации для рухнул бластоцисты. Протокол также дает представление о способности бластоцист восстановить бластоокоэль после потепления.
Например, расширение бластерокоэля после потепления может быть линейным или может быть прервано несколькими большими или меньшими сокращениями. При попытке этой процедуры важно помнить, что эмбрионы должны оставаться в нижней части чашки Петри во время записи, как можно меньше времени, как это возможно. Не забывайте, что высокие концентрации криопротекторов могут быть токсичными для эмбрионов.
После каждого развития, этот метод проложил путь для исследователей в области криобиологии, чтобы изучить эффективность криоконсервации протоколов в программе экстракорпорального оплодотворения.
