Dieses morphometrische Protokoll ermöglicht die Überwachung der Intensität der Blastozystenschrumpfung und -wiederexpansion während früherer Verglasungsinterventionen und der Erholung nach der Erwärmung und gibt Einblicke in die Wirksamkeit von Virusverglasungsmethoden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf In-vitro-Fertilisationslaboratorien mit Zeitraffermikroskopen und Computern mit fortschrittlicher Bildbearbeitungssoftware angewendet werden kann. Am fünften oder sechsten Tag der Expansion, unterziehen Sie eine Blastozyste mit mindestens ein paar inneren Zellmassenzellen und einem kohäsiven Trophektoderm einem 0,4 bis 0,7 Millisekunden Laserpuls mit einem Lochdurchmesser von 4,3 bis 9,4 Mikrometern tangential auf die Zona pellucida und die Kreuzung von zwei benachbarten trophectodermalen Zellen gerichtet.
Dann lassen Sie den Blastocoel für fünf Minuten ganz oder teilweise zusammenbrechen. Als nächstes verwenden Sie eine winzige Pipette, um aseptisch Gleichgewichtsmedium in die Löcher des Mikrotropfenbereichs einer neun-Well-Petrischale hinzuzufügen, die speziell für die Zeitraffermikroskopie und -aufzeichnung entwickelt wurde. Wenn das gesamte Medium hinzugefügt wurde, überlagern Sie den Mikrodropletbereich mit ca. 30 Mikrolitern Gleichgewichtsmedium.
Und tauchen Sie die laserbehandelte Blastozyste in das Gleichgewichtsmedium im Boden eines Mikrotropfenbrunnens der Mikrotropfenschale ein. Sobald die Blastozyste übertragen ist, starten Sie einen Countdown-Timer für 10 Minuten. Und übertragen Sie die Mikrotropfenschale auf die Bühne eines kameraausgestatteten Mikroskops.
Mit einer 200 X Vergrößerung stellen Sie die Mikrotropfenschale so ein, dass die Blastozyste in etwa der Mitte des Aufnahmefensters positioniert ist. Beginnen Sie dann mit der Aufnahme mit der Mikroskopaufnahmesoftware, die die Countdown-Zeit angibt, zu der die Aufnahme gestartet wird. Um die Blastozyste zu lagern, nachdem sie den Embryo in ein Verglasungsstroh geladen hat, versiegeln Sie das Stroh und tauchen Sie das Stroh in flüssigen Stickstoff zwischen 80 und 110 Sekunden Der Ladung, bevor Sie die Blastozyste auf negative 196 Grad Celsius legen.
Um den Querschnittsbereich der überwachten Blastozyste während der Gleichgewichtsphase zu messen, positionieren Sie den Schnellauswahlwerkzeugmarker innerhalb der Blastozyste, bis er den Rand der Blastozyste berührt, und klicken und halten Sie wiederholt die linke Maustaste, um den äußeren Rand der Blastozyste zu skizzieren, bis der gesamte Querschnittsbereich der Blastozyste ausgewählt ist. Klicken Sie dann im Zeitfenster auf das Messprotokoll, und zeichnen Sie die Messungen auf. Für die Blastozysten-Re-Expansion, schnell übertragen sie das HSV-Stroh mit der verglasten Blastozyste aus der Lagerung in ein flüssigstickstoffgefülltes tragbares Reservoir.
Und verwenden Sie Zange, um das Stroh gerade hoch genug zu heben, um die farbige Handhabungsstange freizulegen. Verwenden Sie einen selbsteinstellenden Drahtabstrippen, um das Stroh in der Höhe der farbigen Handhabungsstange zu schneiden. Und die Handhabungsstange mit einer schnellen kontrollierten Bewegung aus dem Stroh holen.
Tauchen Sie den gekrümmten Spachtel der HandlingStab sofort in einen Behälter mit 37 Grad Celsius Auftaulösung. Und wirbeln Sie sanft die Handhabungsstange, um die Blastozyste zu lösen. Nach einer Minute die Blastozyste mit sequenziellen vierminütigen Eintauchen und Verdünnungslösung waschen.
Waschlösung eins und Waschlösung zwei. Als nächstes übertragen Sie die erwärmte Blastozyste in eine vier Brunnenschale mit frischem Regenerationsmedium und verwenden Sie eine Pipette, um die Blastozyste in allen drei Tropfen Medium zu waschen. Nach der letzten Wäsche, übertragen Sie die Blastozyste auf eine neun well Zeitrafferschale, die Erholungsmedium enthält.
Und stellen Sie die neun Brunnenschale unter eine Zeitrafferkamera in einem 37 Grad Celsius, 6%CO2 und 5%O2 Inkubator. Öffnen Sie nun die Zeitraffer-Aufnahmesoftware und wählen Sie eine Aufnahmekamera aus. Wählen Sie den Live-Modus aus, und platzieren Sie den Cursor auf dem Bild.
Scrollen Sie, um das Bild zu vergrößern, und verwenden Sie die linke Maustaste, um den Brunnen mit der Blastozyste in der Mitte des Bildschirms zu positionieren. Verwenden Sie unter Fokussierung die Pfeile, um die Aufnahmeebene der Blastozyste zu fokussieren und unter Lichtintensität die Lichtintensität des Bildes einzustellen. Klicken Sie auf die Mikroskopparameter, um die Belichtungszeit und das Gamma festzulegen, und klicken Sie auf Live-Modus schließen.
Klicken Sie auf Projekt starten, um die Projektdaten einzugeben. Wählen Sie den Kulturschalentyp aus, und deaktivieren Sie alle Positionen mit Ausnahme der zu erfassenden Position. Legen Sie dann das Aufnahmezeitpunkt fest, um alle fünf Minuten ein Foto aufzunehmen, und klicken Sie auf Genehmigen, um die Blastozysten-Re-Erweiterung für mindestens 150 Minuten aufzuzeichnen.
In diesem repräsentativen, kontinuierlich überwachten, intakten Embryo brach die intakte Blastozyste in der Gleichgewichtslösung nicht vollständig zusammen und erweiterte sich nach 10 Minuten Exposition gegenüber Ausgleichslösung wieder auf etwa 70% der ursprünglichen Größe. Im Gegensatz dazu wurde diese künstlich kollabierte Blastozyste unmittelbar nach der Laserbehandlung vollständig aus dem Blastokoel geleert und während der 10 Minuten der Exposition gegenüber der Gleichgewichtslösung wurde keine signifikante Reexpansion beobachtet. Bei der Behandlung mit Vitrifizierungsmedium, das eine hohe Konzentration von Kryoprotektoren enthält, wurde diese gleichgegleichgewichtete intakte Blastozyste einer schrittweisen Reduktion des Blastocoels unterzogen.
Nach der Erwärmung wurde es bei Exposition gegenüber dem Erholungsmedium wieder erweitert. Diese laserpulsierte Blastozyste zeigte jedoch einen sofortigen Zusammenbruch des Blastocoels bei der Behandlung mit dem Laser, der während der Gleichgewichts- oder Verglasungsschritte nicht wiederhergestellt wurde, was die Notwendigkeit einer so langen Gleichgewichtsphase für zusammengebrochene Blastozysten in Frage stellte. Das Protokoll gibt auch Einblick in die Fähigkeit von Blastozysten, Blastocoel nach der Erwärmung zu erholen.
Zum Beispiel kann blastocoel Re-Expansion nach der Erwärmung linear sein, oder kann mit mehreren größeren oder kleineren Kontraktionen unterbrochen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Embryonen während der Aufnahme so wenig Zeit wie möglich am Boden der Petrischale bleiben müssen. Vergessen Sie nicht, dass hohe Konzentrationen von Kryoprotektoren für Embryonen giftig sein können.
Nach jeder Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kryobiologie, um die Wirksamkeit von Kryokonservierungsprotokollen in einem In-vitro-Fertilisationsprogramm zu erforschen.
