Ce protocole morphométrique permet de surveiller l’intensité du rétrécissement et de la ré-expansion du blastocyste lors d’interventions antérieures de vitrification et de récupération post-réchauffement et donne un aperçu de l’efficacité des méthodes de vitrification du virus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée aux laboratoires de fécondation in vitro équipés de microscopes et d’ordinateurs en accéléré dotés d’un logiciel avancé d’édition d’images. Le cinquième ou le sixième jour de l’expansion, soumettez un blastocyste avec au moins quelques cellules de masse cellulaire interne et un trophectoderm cohésif à une impulsion laser de 0,4 à 0,7 milliseconde avec un diamètre de trou allant de 4,3 à 9,4 micromètres tangentiellement dirigés vers la zona pellucida et la jonction de deux cellules trophectodermiques adjacentes.
Ensuite, laissez le blastocoel s’effondrer complètement ou partiellement pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez une pipette minuscule pour ajouter de façon aseptique un milieu d’équilibrage dans les trous de la zone microdroplet d’une boîte de Pétri de neuf puits, spécialement conçue pour la microscopie et l’enregistrement en accéléré. Lorsque tout le milieu a été ajouté, superposer la zone microdroplet avec environ 30 microlitres de milieu d’équilibrage.
Et submergez le blastocyste traité au laser dans le milieu d’équilibrage au fond d’un puits de microdroplet du plat de microdroplet. Dès que le blastocyste est transféré, démarrez une minuterie de compte à rebours pendant 10 minutes. Et transférer le plat de microdroplet sur la scène d’un microscope équipé d’une caméra.
À l’aide d’un grossissement de 200 X, réglez le plat de microdroplet de sorte que le blastocyste soit placé à peu près au centre de la fenêtre d’enregistrement. Ensuite, commencez à enregistrer avec le logiciel d’enregistrement au microscope en notant le temps de compte à rebours auquel l’enregistrement est commencé. Pour stocker le blastocyste, après avoir chargé l’embryon dans une paille de vitrification, sceller la paille et plonger la paille dans de l’azote liquide entre 80 et 110 secondes de chargement, avant de placer le blastocyste à 196 degrés Celsius négatifs.
Pour mesurer la zone transversale du blastocyste surveillé pendant la phase d’équilibrage, placez le marqueur d’outil de sélection rapide à l’intérieur du blastocyste jusqu’à ce qu’il touche le bord du blastocyste et cliquez à plusieurs reprises et maintenez le bouton de la souris gauche pour décrire le bord extérieur du blastocyste jusqu’à ce que toute la zone transversale du blastocyste ait été sélectionnée. Ensuite, dans la fenêtre de chronologie, cliquez sur le journal de mesure et enregistrez les mesures. Pour la ré-expansion du blastocyste, transférez rapidement la paille HSV avec le blastocyste vitrifié du stockage à un réservoir portatif rempli d’azote liquide.
Et utilisez des forceps pour soulever la paille juste assez haut pour exposer la tige de manipulation colorée. Utilisez une décapant de fil auto-ajustable pour couper la paille à la hauteur de la tige de manutention colorée. Et extraire la tige de manipulation de la paille avec un mouvement contrôlé rapide.
Plongez immédiatement la spatule incurvée de la tige de manutention dans un récipient de 37 degrés Celsius solution de dégel. Et faites pivoter doucement la tige de manipulation pour détacher le blastocyste. Après une minute, laver le blastocyste avec des immersions séquentielles de quatre minutes et une solution de dilution.
Solution de lavage un, et solution de lavage deux. Ensuite, transférez le blastocyste réchauffé dans un plat de quatre puits contenant un milieu de récupération frais et utilisez une pipette pour laver le blastocyste dans les trois gouttes de milieu. Après le dernier lavage, transférer le blastocyste dans un plat de neuf puits en accéléré, contenant un milieu de récupération.
Et placez le plat de neuf puits sous une caméra en accéléré dans un incubateur de 37 degrés Celsius, 6 % de CO2 et 5 % d’O2. Maintenant, ouvrez le logiciel d’enregistrement time-lapse et sélectionnez une caméra d’enregistrement. Sélectionnez le mode live et placez le curseur sur l’image.
Faites défiler pour agrandir l’image et utilisez le bouton de la souris gauche pour positionner le puits contenant le blastocyste au milieu de l’écran. Sous la mise au point, utilisez les flèches pour concentrer le plan d’enregistrement du blastocyste et sous l’intensité lumineuse définir l’intensité lumineuse de l’image. Cliquez sur les paramètres du microscope pour définir le temps d’exposition et gamma, et cliquez sur fermer le mode live.
Cliquez sur démarrer le projet pour saisir les données du projet. Sélectionnez le type de plat de culture et décochez toutes les positions sauf celle à enregistrer. Ensuite, définissez le calendrier de capture pour prendre une photo toutes les cinq minutes et cliquez sur approuver pour enregistrer la ré-extension blastocyste pendant au moins 150 minutes.
Dans cet embryon intact, surveillé en permanence, le blastocyste intact ne s’est pas complètement effondré dans la solution d’équilibrage et s’est réexcité à environ 70 % de la taille d’origine, après 10 minutes d’exposition à la solution d’équilibrage. En revanche, ce blastocyste artificiellement effondré a été complètement vidé du blastocoel immédiatement après traitement au laser et aucune réexa expansion significative n’a été observée pendant les 10 minutes d’exposition à la solution d’équilibrage. Au traitement avec le milieu de vitrification, contenant une concentration élevée de cryoprotectants, ce blastocyste intact équilibré a subi une réduction step-sage du blastocoel.
Après le réchauffement, il s’est de nouveau élargi lors de l’exposition au milieu de récupération. Ce blastocyste pulsé au laser a toutefois démontré un effondrement immédiat du blastocoel lors du traitement au laser, qui n’a pas été récupéré pendant les étapes d’équilibration ou de vitrification, mettant en doute la nécessité d’une phase d’équilibrage aussi longue pour les blastocystes effondrés. Le protocole donne également un aperçu de la capacité des blastocystes à récupérer le blastocoel après le réchauffement.
Par exemple, la ré-expansion du blastocoel après le réchauffement peut être linéaire, ou peut être interrompue par plusieurs contractions plus grandes ou plus petites. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les embryons doivent rester au fond de la boîte de Pétri pendant l’enregistrement, pour aussi peu de temps que possible. N’oubliez pas que des concentrations élevées de cryoprotecteurs peuvent être toxiques pour les embryons.
Après chaque développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la cryobiologie, afin d’explorer l’efficacité des protocoles de cryopréservation dans un programme de fécondation in vitro.
