פרוטוקול מורפומטרי זה מאפשר ניטור של עוצמת הצטמקות blastocyst והתרחבות מחדש במהלך התערבויות vitrification מראש והתאוששות שלאחר ההתחממות ומספק תובנות על האפקטיביות של שיטות vitrification וירוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה על מעבדות הפריה חוץ גופית המצוידות במיקרוסקופים ומחשבים עם תוכנה מתקדמת לעריכת תמונות. ביום החמישי או השישי של ההתפשטות, נושא blastocyst עם לפחות כמה תאים המוניים תאים פנימיים ו trophectoderm מגומד ל 0.4 כדי 0.7 אלפית שנייה פעימת לייזר עם קוטר חור הנע בין 4.3 ל 9.4 מיקרומטר מכוון באופן משיק אל pellucida ואת הצומת של שני תאים trophectodermal סמוכים.
לאחר מכן, לאפשר את blastocoel להתמוטט באופן מלא או חלקי במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמשו בפיפט זעיר כדי להוסיף באופן בלתי ניתן להשגת מדיום שיווי משקל לתוך החורים של אזור המיקרו-דרופלט של צלחת פטרי בת תשע בארות, שתוכננה במיוחד למיקרוסקופיה והקלטה של זמן לשגות. כאשר כל המדיום נוסף, שכב את אזור המיקרודופת בכ-30 מיקרוליטרים של מדיום שיווי משקל.
וטביעה את בלסטוציסט שטופל בלייזר במדיום שיווי המשקל בתחתית באר מיקרודרופת אחת של צלחת המיקרו-דרופלט. ברגע שהפלסט מועבר, התחל טיימר ספירה לאחור למשך 10 דקות. ולהעביר את צלחת המיקרו-דרופלט על הבמה של מיקרוסקופ מצויד במצלמה.
באמצעות הגדלה של 200 X, התאימו את צלחת המיקרו-דרופלט כך שה-blastocyst ימוקם בערך במרכז חלון ההקלטה. לאחר מכן, התחל להקליט עם תוכנת הקלטת המיקרוסקופ ונוהג בזמן הספירה לאחור שבו ההקלטה מתחילה. כדי לאחסן את blastocyst, לאחר טעינת העובר לתוך קש vitrification, לאטום את הקש, לצלול את הקש לתוך חנקן נוזלי בין 80 ל 110 שניות של טעינה, לפני הצבת blastocyst ב שלילי 196 מעלות צלזיוס.
כדי למדוד את האזור חתך של blastocyst פיקוח במהלך שלב שיווי המשקל, למקם את סמן כלי הבחירה המהירה בתוך blastocyst עד שהוא נוגע בקצה blastocyst שוב ושוב לחץ והחזק את לחצן העכבר השמאלי כדי להתוות את הקצה החיצוני של blastocyst עד האזור חתך כולו של blastocyst נבחר. לאחר מכן, בחלון ציר הזמן, לחץ על יומן המדידות ומדידות הרשומות. להתרחבות מחדש של blastocyst, העבר במהירות את קש HSV עם הפיצוץ הוויטרי מאחסון למאגר נייד מלא חנקן נוזלי.
ולהשתמש במדפים כדי להרים את הקש רק גבוה מספיק כדי לחשוף את מוט הטיפול הצבעוני. השתמש בחשפנית תיל להתאמה עצמית כדי לחתוך את הקש בגובה מוט הטיפול הצבעוני. ולחלץ את מוט הטיפול מהקש עם תנועה מבוקרת מהירה.
מיד לצלול מרית מעוגלת של מוט הטיפול לתוך מיכל של 37 מעלות צלזיוס הפשרת פתרון. ובעדינות לסובב את מוט הטיפול כדי לנתק את blastocyst. לאחר דקה אחת, לשטוף את blastocyst עם טבילות ארבע דקות רציפות פתרון דילול.
פתרון כביסה אחד, ופתרון כביסה 2. לאחר מכן, להעביר את blastocyst מחומם לתוך צלחת ארבע גם המכיל מדיום התאוששות טרי ולהשתמש פיפטה לשטוף את blastocyst בכל שלוש טיפות של מדיום. לאחר הכביסה האחרונה, מעבירים את ה-blastocyst לצלחת של תשעה בארות, המכילה מדיום התאוששות.
והצב את המנה תשעה גם תחת מצלמה לשגות זמן ב 37 מעלות צלזיוס, 6% CO2 ו 5% O2 אינקובטור. עכשיו, לפתוח את תוכנת הקלטת זמן לשגות ולבחור מצלמת הקלטה. בחרו 'מצב חי' והמקמו את הסמן על התמונה.
גלול כדי להגדיל את התמונה ולהשתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי למקם את הבאר המכילה את blastocyst באמצע המסך. תחת התמקדות, השתמש בחצים כדי למקד את מישור ההקלטה של blastocyst ותחת עוצמת האור להגדיר את עוצמת האור של התמונה. לחצו על פרמטרי מיקרוסקופ כדי להגדיר את זמן החשיפה ואת הגמא ולחצו על 'סגור מצב חי'.
לחץ על התחל פרוייקט כדי להזין את נתוני הפרוייקט. בחר את סוג צלחת התרבות ו בטל את הסימון של כל המיקומים למעט זה שיש להקליט. לאחר מכן, הגדר את תזמון הלכידה כדי לצלם תמונה כל חמש דקות ולחץ על אשר כדי לתעד את ההרחבה מחדש של blastocyst למשך 150 דקות לפחות.
בנציג זה, במעקב רציף, עובר שלם, blastocyst שלם לא התמוטט לחלוטין בתתברית שיווי המשקל והתרחב מחדש על 70% מהגודל המקורי, לאחר 10 דקות של חשיפה לפתרון שיווי משקל. לעומת זאת, בלסטוציסט שקרס באופן מלאכותי התרוקן לחלוטין מהבלסטוקול מיד לאחר טיפול הלייזר ולא נצפתה התרחבות משמעותית במהלך 10 הדקות של החשיפה לפתרון שיווי המשקל. עם הטיפול במדיום vitrification, המכיל ריכוז גבוה של cryoprotectants, זה באסטוציסט שלם שיווי משקל עבר הפחתה צעד חכם של blastocoel.
לאחר ההתחממות, הוא התרחב שוב עם חשיפה למדיום התאוששות. בלסטוציסט זה פעמו בלייזר עם זאת, הפגין קריסה מיידית של blastocoel על הטיפול בלייזר, זה לא התאושש במהלך שיווי משקל או צעדים vitrification, להביא בחשבון את הצורך של שלב שיווי משקל ארוך כזה עבור blastocysts התמוטט. הפרוטוקול גם נותן תובנה על היכולת של blastocysts לשחזר blastocoel לאחר ההתחממות.
לדוגמה, התפשטות מחדש של בלסטוקול לאחר ההתחממות יכולה להיות ליניארית, או שניתן להפריע לה עם מספר התכווצויות גדולות או קטנות יותר. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי העוברים חייבים להישאר בתחתית צלחת פטרי במהלך ההקלטה, במשך זמן קצר ככל האפשר. אל תשכח כי ריכוזים גבוהים של cryoprotectants יכול להיות רעיל לעוברים.
לאחר כל התפתחות, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההקפאה, לחקור את האפקטיביות של פרוטוקולי cryopreservation בתוכנית הפריה חוץ גופית.
