La investigación de los procesos a nivel genético y proteico es crucial en la investigación de cultivos. Nuestro enfoque permite la inspección de proteínas de laberinto secretadas con la resolución temporal espacial más alta en diferentes lados y tejidos de infección. El método de caballo de Troya explora las capacidades de secretor automáticas útiles.
Elude las transformaciones de laberinto que consumen mucho tiempo y las transformaciones desafiantes del laberinto, y facilita estudios detallados sobre proteínas secretadas dentro de la appelplatz del laberinto. Información detallada sobre la infección adecuada de hojas de laberinto añadidas, borlas y oído. Y muestra el estudio exitoso de la progresión de la infección y la función proteica en el tejido objetivo.
Demostrando el procedimiento estará Isabell Fiedler, una estudiante de posgrado del laboratorio. Para comenzar el experimento, rasque a Eumadous de una placa de pediatra usando una pipeta pasteur estéril. Inocular 5 mililitros de YEPS Light Medium con Eumadous.
Crecer el cultivo a 28 grados centígrados, con un temblor constante a 200 rpm durante 16 horas. Al día siguiente mezcla 900 microlitros de YEPS Light fresco con 100 microlitros del cultivo nocturno. Mida el OD-600 utilizando YEPS Light Medium como un espacio en blanco en el análisis del espectrofotómetro.
Diluir el cultivo nocturno con YEPS Light Medium fresco a un OD-600 de 2. Deje que el cultivo crezca a 28 grados celsius con temblores constantes a 200 rpm, hasta que alcance la fase de crecimiento del tronco medio, indicado por un OD-600 de 8 a 1,0. Después de la incubación, cosechar las células girando a 3000 veces chi durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante. A continuación, lave la pilette de celda una vez con 1 volumen de cultivo de DDH2O. Gire las células a 3000 veces chi durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.
Luego, vuelva a suspender cuidadosamente la pilette de la celda en DDH2O, usando una pipeta de vidrio de 20 mililitros. Ajustando así el OD-600 final a 3.0 para un ensayo de Caballo de Troya o 1.0 para la clasificación de la enfermedad. Cultivar las plantas del laberinto a una etapa de hojas adultas, donde al menos la hoja 7 crece dentro del tallo.
A continuación, transfiera el cultivo de Eumadous a una jeringa de 3 mililitros con una aguja hipodérmica bi una de calibre 20. Presione el tallo cuidadosamente para localizar el tejido del tallo del espejo. La base del tallo de espejo se puede distinguir por una transición de tallo más duro a tejido más blando.
Marca el tallo de espejo en el tallo usando un bolígrafo. Inyectar 1,5 mililitros de cultivo de Eumadous 1 centímetro por encima del tallo de espejo de brote o tallo de espejo de inflorescencia. Una vez que las plantas del laberinto lleguen a la etapa de borla, presione el tallo cuidadosamente para localizar la borla en el tallo.
Marque la punta y la base de la borla en el tallo usando una pluma. Transfiera el cultivo de Eumadous a una jeringa de 3 mililitros con una aguja hipodérmica bi una de calibre 20 para inyectar un total de 1,5 mililitros del inóculo alrededor de la borla. Para asegurar la distribución equitativa del inóculo, coloque lentamente 5 mililitros en la punta, el centro y la base de la borla marcada con la pluma.
Transfiera el cultivo de Eumadous a una jeringa de 3 mililitros con una aguja hipodérmica bi una calibre 20. Inyecte la aguja de inoculación en el espacio entre las hojas de cáscara lo más profundamente posible sin herir la oreja, luego libere 1,5 mililitros del inóculo alrededor de la oreja. A continuación, retire la jeringa y la aguja y masajee cuidadosamente la mazorca para distribuir la solución de Eumadous por igual.
Suelte 10 microlitros de inóculo en una placa de sinfín de carbón PD. A continuación, incubar a temperatura ambiente durante 2 días. Hyphae secretando ZM Mach1 están rodeados de señal fluorescente y cereza.
Por el contrario, las hifas no secreantes sólo muestran señal fluorescente en el citoplasma fúngico. La localización inadecuada de la borla o la distribución desigual del inóculo pueden dar lugar a borlas no infectadas o sólo a una infección parcial de la borla en comparación con la distribución uniforme. La cepa patógena de Trojan Progenester SG-200, cultivada en la cola de carbón PD, forma filamentos de pelusa blanca en la placa como se muestra.
Mientras que la cepa Eumadous FB1 requiere apareamiento antes de la formación de filamentos infecciosos. Después de la infección, la posible respuesta de los signos de la proteína hepática de caballo de Troya se puede analizar utilizando varios métodos, incluyendo clasificaciones de enfermedades o imágenes microscópicas. Para muchos patógenos, la transformación y la secreción son bien entendidas y se pueden explorar de una manera similar.
Por lo tanto, permiten el estudio del host, que no son susceptibles a la transformación.
